近期，南京大學(xué)張晶晶教授研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)上述新型PROTAC策略的局限性，以miRNA觸發(fā)的DNA編碼的pre-PROTAC的形態(tài)調(diào)節(jié)為依據(jù)，成功開發(fā)出一種全新的miRNA啟動(dòng)的組裝pre-PROTAC平臺(tái)——miRiaTAC。

       傳統(tǒng)PROTAC技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)

       靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs）作為一種極具前景的治療策略，通過利用細(xì)胞天然蛋白質(zhì)降解機(jī)制靶向消除疾病相關(guān)蛋白，展現(xiàn)出與傳統(tǒng)占位驅(qū)動(dòng)抑制劑不同的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如在低劑量下發(fā)揮催化作用以及降解頑固蛋白等（圖1）。

圖1. 基于靶蛋白降解的各種嵌合體策略

       然而，在臨床應(yīng)用中，PROTACs面臨著諸多挑戰(zhàn)。

       首先，腫瘤選擇性差是一個(gè)突出問題。由于無法精準(zhǔn)區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，PROTACs在發(fā)揮作用時(shí)可能會(huì)對(duì)正常組織造成不良影響，降低了治療的特異性。這種缺乏腫瘤選擇性的特性可能導(dǎo)致治療效果受限，同時(shí)增加了患者出現(xiàn)副作用的風(fēng)險(xiǎn)。

       其次，蛋白質(zhì)不受控制的降解帶來了非癌組織全身毒性風(fēng)險(xiǎn)。PROTACs引發(fā)的蛋白質(zhì)降解若失去控制，可能會(huì)對(duì)正常組織和器官的蛋白質(zhì)平衡產(chǎn)生破壞，干擾人體正常的生理功能。這種全身毒性風(fēng)險(xiǎn)不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能對(duì)治療的安全性和可持續(xù)性構(gòu)成威脅。

       此外，過度激活也是PROTACs面臨的挑戰(zhàn)之一。過度激活可能引發(fā)一系列未知的生理反應(yīng)或副作用，進(jìn)一步加重患者的病情或?qū)е滦碌慕】祮栴}。這種不確定性增加了治療的復(fù)雜性和風(fēng)險(xiǎn)。

       因此，研發(fā)一種按需開關(guān)策略，以實(shí)現(xiàn)選擇性激活和終止PROTACs介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。這將有助于提高PROTACs的治療特異性和安全性，為其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

       新型PROTAC技術(shù)對(duì)副作用的優(yōu)化策略

       1、Nano-PROTACs策略

       2023年7月，國(guó)家納米科學(xué)中心的王浩研究員開發(fā)了一種用于腫瘤治療的Nano-PROTACs技術(shù)，該技術(shù)旨在解決傳統(tǒng)PROTACs的問題。其設(shè)計(jì)的Nano-PROTAC 系統(tǒng)由含特定結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)肽基前體組成，在腫瘤細(xì)胞高GSH水平下經(jīng)點(diǎn)擊反應(yīng)自組裝成有序納米結(jié)構(gòu)。

圖2. 原位自組裝Nano-protacs的示意圖

       體外研究表明，它能形成多元納米復(fù)合物，有效降解EGFR和AR等蛋白，且具有劑量依賴性和抗鉤效應(yīng)。體內(nèi)研究顯示，Nano-PROTACs可在腫瘤部位富集和保留，在荷瘤小鼠模型中呈現(xiàn)劑量依賴性的腫瘤抑制效果，通過降解靶蛋白誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)該系統(tǒng)具有良好生物相容性和細(xì)胞選擇性。

       Nano-PROTAC技術(shù)雖然在蛋白降解領(lǐng)域顯示出巨大潛力，但仍面臨靶點(diǎn)單一、不能即時(shí)終止降解過程和制造成本昂貴等多方面的挑戰(zhàn)。

       2、Ligation to Scavenging策略

       在探索靶蛋白可控降解以及按需終止相關(guān)問題的進(jìn)程中，中國(guó)藥科大學(xué)姜正羽教授研究團(tuán)隊(duì)于2023年3月開創(chuàng)性地提出了一種能夠即時(shí)終止蛋白降解過程的連接-清除（Ligation to Scavenging）策略（圖3）。

圖3. 受控的PROTACs和連接-清除系統(tǒng)示意圖

       該策略由經(jīng)反式環(huán)辛烯（TCO）修飾的樹枝狀大分子（PAMAM-G5-TCO）以及四嗪標(biāo)記的PROTACs（Tz-PROTACs）這兩個(gè)關(guān)鍵部分構(gòu)成。其中，PAMAM-G5-TCO能夠借助逆電子需求的Diels-Alder反應(yīng)（IEDDA），快速且有效地清除細(xì)胞內(nèi)處于游離狀態(tài)的PROTACs，進(jìn)而達(dá)成對(duì)靶向蛋白降解過程的終止調(diào)控。通過這一調(diào)控機(jī)制，那些已經(jīng)出現(xiàn)下調(diào)情況的靶蛋白能夠逐步恢復(fù)到正常水平。

       在研究過程中，研究人員針對(duì)BET蛋白、PARP蛋白等多個(gè)底物蛋白展開了降解終止的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，充分論證了該策略具備可靠性以及廣泛的適用性，為PROTAC降解技術(shù)裝上了可靠的“剎車”。

       然而，該策略在選擇性和特異性方面可能會(huì)受到特定靶蛋白以及降解條件的限制，這一局限給這一頗具潛力的策略未來發(fā)展蒙上了一層陰影。

       3、DbTAC策略

       2023年7月，中國(guó)藥科大學(xué)馬祎教授研究團(tuán)隊(duì)受到DNA框架所具備的可尋址性、可編程性以及剛性特質(zhì)的啟發(fā)，成功開發(fā)出基于共價(jià)DNA框架的PROTACs（DbTACs）。這種DbTACs能夠借助簡(jiǎn)單的生物正交化學(xué)以及自組裝方式，實(shí)現(xiàn)高通量合成（圖4）。

圖4. 選擇性靶向蛋白降解的DbTACs平臺(tái)設(shè)計(jì)示意圖

       在其構(gòu)建過程中，采用DNA四面體作為模板，此模板能夠精準(zhǔn)地定義每個(gè)原子的空間位置?；谶@一特性，通過在模板上對(duì)POI和E3連接酶的配體進(jìn)行精確的定位操作，就能夠?qū)ε潴w間距進(jìn)行有效控制，其范圍可從8 Å到57 Å。研究人員經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，具有配體之間最 佳連接長(zhǎng)度的dbtac，展現(xiàn)出了更高的降解率以及更強(qiáng)的結(jié)合親和力。

       此外，具有三價(jià)配體組裝的雙特異性DbTACs（雙-DbTACs）表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，它能夠在確保對(duì)蛋白質(zhì)亞型進(jìn)行高度選擇性降解的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的消耗。而且，當(dāng)運(yùn)用不同類型的彈頭，如小分子、抗體以及DNA基元時(shí)，DbTACs在針對(duì)多種靶標(biāo)進(jìn)行降解方面彰顯出強(qiáng)大的功效，這些靶標(biāo)涵蓋了位于不同細(xì)胞區(qū)室的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等。

       DbTACs這一策略突破了傳統(tǒng)PROTAC分子僅能降解單一靶點(diǎn)的局限，然而，它也面臨著一些挑戰(zhàn)，例如無法即時(shí)終止降解過程且不具有細(xì)胞選擇性等。

       4、Dual-PROTAC策略

       2021年5月，華中科技大學(xué)同濟(jì)藥學(xué)院李華教授研究團(tuán)隊(duì)，鑒于單一靶點(diǎn)治療存在諸多局限，創(chuàng)新性地提出了雙靶向PROTAC分子（Dual-PROTAC）這一概念。

       受到雙靶向藥物的啟發(fā)，研究人員設(shè)計(jì)并合成了一種能夠同時(shí)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）進(jìn)行降解的雙靶點(diǎn)PROTAC分子。在合成過程中，研究團(tuán)隊(duì)巧妙地運(yùn)用天然氨基酸作為連接體，并選取吉非替尼、奧拉帕利以及CRBN或VHL的E3配體作為底物來合成相關(guān)分子（圖5）。

       圖5. Dual-PROTAC策略示意圖

       細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所合成的雙靶點(diǎn)PROTAC在SW1990和H1299細(xì)胞系中，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR和PARP的降解，并且其降解效果呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴性。此研究首次成功實(shí)現(xiàn)一個(gè)小分子同時(shí)降解兩種不同靶蛋白，拓展了PROTAC技術(shù)應(yīng)用并開辟藥物發(fā)現(xiàn)新領(lǐng)域，然而該策略可能會(huì)由于分子量的增加，從而引發(fā)藥物性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)方面的一系列問題。

       miRNA-觸發(fā)DNA編碼的前PROTAC平臺(tái)

       DNA具備可編程性，這一特性使其能夠構(gòu)建多種多樣的納米結(jié)構(gòu)，進(jìn)而為動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。近期，南京大學(xué)張晶晶教授研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)上述新型PROTAC策略的局限性，以miRNA觸發(fā)的DNA編碼的pre-PROTAC的形態(tài)調(diào)節(jié)為依據(jù)，成功開發(fā)出一種全新的miRNA啟動(dòng)的組裝pre-PROTAC平臺(tái)，即miRiaTAC。

       miRiaTAC的模塊化工具包含一對(duì)可修飾的DNA發(fā)夾H1和H2。在癌細(xì)胞中，靶miR -21呈現(xiàn)過表達(dá)的狀態(tài)，H1和H2能夠?qū)ζ渥龀鲰憫?yīng)，并通過HCR形成交替共聚物。具體而言，彈頭JQ-1（L1）標(biāo)記的H1可以招募靶蛋白BRD4，而H2與配體pomalidomide（L2）結(jié)合以招募CRBN E3泛素連接酶。精確確定L1和L2的修飾位點(diǎn)，以確保在miR-21啟動(dòng)時(shí)L1/L2對(duì)的鄰近性，使miRiaTAC誘導(dǎo)BRD4多泛素化，引起其蛋白酶體介導(dǎo)的降解，并形成（BRD4）m:miRiaTAC:(E3)n復(fù)合物（圖6）。

       圖6. 原位miRNA啟動(dòng)組裝預(yù)protac（miRiaTAC）系統(tǒng)的示意圖

       為了進(jìn)一步降低過度降解所帶來的副作用，研究人員設(shè)計(jì)了一種用于時(shí)空控制終止蛋白質(zhì)降解的概念策略。他們通過在合適的位置插入可光性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)長(zhǎng)dsDNA納米結(jié)構(gòu)拆卸過程的光學(xué)調(diào)節(jié)，從而構(gòu)建出一個(gè)具有理想可控性的系統(tǒng)。針對(duì)多重蛋白降解這一挑戰(zhàn)，研究人員將另一種配體（L3）添加到H1上，以此來募集CDK6。借助可編程的配體比例，成功實(shí)現(xiàn)了正交多靶點(diǎn)降解（圖7）。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了miRiaTAC在小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性以及顯著的腫瘤抑制效果。

圖7. miRiaTAC的多重蛋白降解模式

       miRiaTAC策略通過插入光不穩(wěn)定基團(tuán)實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)降解的時(shí)空控制終止，避免了過度蛋白降解。同時(shí)，研究人員設(shè)計(jì)了一種新的DNA編碼預(yù)PROTAC（H1-Pal），可實(shí)現(xiàn)單靶點(diǎn)和雙靶點(diǎn)蛋白降解，拓寬了miRiaTAC在多靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用。

       總之，miRiaTAC平臺(tái)解決了傳統(tǒng)PROTACs和miRNA療法的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，為開發(fā)下一代靶向癌癥治療提供了有前景的途徑。

       參考文獻(xiàn)：

       [1]Zhang, Ni-Yuan et al. “Nano Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) with Anti-Hook Effect for Tumor Therapy.” Angewandte Chemie (International ed. in English) vol. 62,37 (2023): e202308049. doi:10.1002/anie.202308049

       [2]Jin, Yuhui et al. “Ligation to Scavenging Strategy Enables On-Demand Termination of Targeted Protein Degradation.” Journal of the American Chemical Society vol. 145,13 (2023): 7218-7229. doi:10.1021/jacs.2c12809

       [3]Zhou, Li et al. “DNA framework-engineered chimeras platform enables selectively targeted protein degradation.” Nature communications vol. 14,1 4510. 27 Jul. 2023, doi:10.1038/s41467-023-40244-7

       [4]Zheng, Mengzhu et al. “Rational Design and Synthesis of Novel Dual PROTACs for Simultaneous Degradation of EGFR and PARP.” Journal of medicinal chemistry vol. 64,11 (2021): 7839-7852. doi:10.1021/acs.jmedchem.1c00649

       [5]Hollingsworth, S., Johnson, S., Khakbaz, P. et al. The rise of targeting chimeras (TACs): next-generation medicines that preempt cellular events. Med Chem Res 32, 1294–1314 (2023). https://doi.org/10.1007/s00044-023-03104-z

       [6]Zhan, Jiayin et al. “MicroRNA-Triggered Programmable DNA-Encoded Pre-PROTACs for Cell-Selective and Controlled Protein Degradation.” Angewandte Chemie (International ed. in English), e202415323. 9 Oct. 2024, doi:10.1002/anie.202415323