雖然液相質(zhì)譜價格比較昂貴，但隨著工業(yè)的發(fā)展，越來越多實驗室把液相質(zhì)譜應(yīng)用到藥物分析當中，形成有效的質(zhì)量監(jiān)控體系。液相質(zhì)譜可以應(yīng)用于藥物代謝學(xué)、藥物殘留檢測、基因毒性、藥物代謝動力學(xué)等的研究。隨著儀器及其配套智能化軟件的不斷改進，建立一種生物樣品中藥物、代謝物或其他物質(zhì)的測定方法逐漸變得簡便起來。但是在實際應(yīng)用中，藥物分析方法學(xué)研究仍然面臨許多挑戰(zhàn)，例如：待測物什么情況下需要采用衍生化，并且如何選擇合適的衍生化試劑；如何有效地對體內(nèi)多組分樣品進行同時測定；如何正確地認識并且科學(xué)地評價基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng)；如何正確處理高通量分析和專屬性之間的關(guān)系等。
如何有效地使用液相質(zhì)譜成為藥物分析的一個重點難點問題。本文基于前期的研究，總結(jié)出一些關(guān)鍵步驟以及應(yīng)用解決方案。
步驟1，首先，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)，判斷其是否適用于液相質(zhì)譜的檢測。
這是最重要的一個步驟，并不是所有的化合物都能夠在液相質(zhì)譜顯示非常好的響應(yīng)值，這與化合物的結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性。能夠被液相質(zhì)譜測定的物質(zhì)，大部分是能夠在液相質(zhì)譜內(nèi)電離成正負離子或者形成加合離子，例如氫離子加合、鉀離子加合、銨根離子加合等等。以噁唑菌酮為例，即使其結(jié)構(gòu)存在N原子、O原子，但其在液相質(zhì)譜響應(yīng)值并不高，需要加入乙酸銨進行銨根離子加合才能提高其響應(yīng)值。那么，什么樣的結(jié)構(gòu)才更適合在液相質(zhì)譜測定？筆者總結(jié)出各種不同結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)物質(zhì)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)提出不同的處理方式，提高其在液相質(zhì)譜的響應(yīng)值。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表成國內(nèi)外為數(shù)不多的比較詳細的應(yīng)用總結(jié)[1-2]。
圖１ 噁唑菌酮結(jié)構(gòu)式與加合形式
步驟2，當化合物結(jié)構(gòu)不適合在液相質(zhì)譜檢測時，考慮是否進行衍生反應(yīng)。
衍生反應(yīng)在提高化合物響應(yīng)值方面有著廣泛的應(yīng)用，但衍生反應(yīng)對化合物的結(jié)構(gòu)有一定的要求，選用什么類型的衍生方式同樣重要（見表1）。如果化合物沒有合適的官能團，那么選擇合適的衍生方式就具有挑戰(zhàn)性。常見能夠進行衍生反應(yīng)的官能團有羥基、氨基、雙鍵、三鍵等基團。藥物中的基因毒性分析，經(jīng)常采用衍生方式在液相質(zhì)譜測定基因毒物的含量[3]。關(guān)于衍生反應(yīng)方面的綜述比較多，詳見參考文獻[1-5]。
表1 衍生反應(yīng)的類型與試劑
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物質(zhì)類型 |
反應(yīng)類型 |
衍生試劑 |
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醛酮類化合物 |
腙化反應(yīng) |
苯并吖啶酮-5-乙酸酰肼、羅丹明B酰肼 |
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醇類化合物 胺類化合物 |
親核反應(yīng) 酯化或酰胺化反應(yīng) |
丹磺酰氯衍生、2-氟-1-甲基吡啶、羅丹明B |
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烯烴、炔烴 |
官能團化反應(yīng) |
亞砜氯化物、高錳酸鉀、過氧苯甲酸等 |
步驟3，當化合物沒有適合衍生的官能團時，考慮是否采用一些特殊的化學(xué)反應(yīng)。
大部分離子源，例如ESI、APCI等，都是采用高壓電進行離子化。這時，質(zhì)譜分析過程中會發(fā)生化學(xué)氧化還原或者電暈氧化還原反應(yīng)兩類反應(yīng)[6]。例如，在水溶液中：2H2O-4e-=4H++O2，在氯化鈉溶液中：2Cl--2e-=Cl2。與此同時，電暈放電能夠產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，例如•O、•NO、O3、H2O2等，這些活性氧物質(zhì)與分析物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而為液相質(zhì)譜測定物質(zhì)提供條件。比較典型的例子是殺螟丹的測定，殺螟丹在離子源轉(zhuǎn)化成比較穩(wěn)定的沙蠶毒素，從而被檢測得到，見圖2。
圖2 殺螟丹液相質(zhì)譜測定示意圖
在流動相或者外界條件中添加其它物質(zhì)進行光化學(xué)反應(yīng)也是一種很好的方式。例如在流動相里添加丙酮、二苯甲酮等進行在線光化學(xué)反應(yīng)(PB光化學(xué)反應(yīng))，可以精確鑒定碳碳雙鍵的位置和雙鍵異構(gòu)體的相對含量[7]。
步驟4，當衍生、特殊化學(xué)反應(yīng)等措施都不奏效時，可以考慮購買不同類型的離子源。
離子源價格比較昂貴，但采用常見的化學(xué)手段效果不理想時，選購新的離子源也是一種可以考慮的方式。比較適用于研究的離子源有APCI、DESI、DART、APPI等，見表2。
表2 不同離子源的測定物質(zhì)
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離子源類型 |
測定物質(zhì) |
可能涉及的離子化原理 |
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APCI |
多溴聯(lián)苯、三硝 基甲苯等 |
放電針電暈放電 |
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APPI |
多環(huán)芳烴等 |
光能激發(fā)氣態(tài)分子 |
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DESI |
黑索 今等 |
電噴霧離子化 |
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DART |
低分子小分子 |
輝光放電形成等離子體 |
步驟5，根據(jù)藥物的特性，選用合適的凈化手段。
目前，藥物分析的樣品前處理技術(shù)報道屢見不鮮，例如，固相萃取(SPE)、固相微萃取、加速溶劑萃取、超臨界流體萃取、液-液分配、凝膠滲透色譜、分散固相萃取(QuEChERS)、基質(zhì)固相分散等技術(shù)。液-液分配是比較常用的一種提取凈化方式，但對于藥物等基質(zhì)復(fù)雜的物質(zhì)，顯然，液-液分配并不足夠應(yīng)付日常工作?？茖W(xué)家們相繼發(fā)明了SPE等凈化方式，從而有效地去除基質(zhì)的干擾，基于SPE研究基礎(chǔ)上，分散固相萃取(QuEChERS)、固相微萃取等技術(shù)發(fā)展迅速。加速溶劑萃取、超臨界流體萃取、凝膠滲透色譜等手段具有各自的特點，選用這些凈化方式，主要考慮成本等因素。因此，實驗室可根據(jù)成本、效率等，選用合適的凈化手段。
本文總結(jié)了應(yīng)用液相質(zhì)譜進行藥物分析的相應(yīng)步驟，為不同類型的實驗室，例如藥物代謝研究、藥物殘留研究、藥物原料或者輔料質(zhì)量控制、基因毒性控制等，提供可參考的應(yīng)用步驟，從而提高檢測效率。
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[2]Hayen H，Karst U. Strategies for the liquid chromatographic–mass spectrometric analysis of non-polar compounds[J]. Journal of Chromatography A，2003，1000(1):549.
[3]王康林,孫月婷.液相色譜-質(zhì)譜-衍生化測定伊馬替尼中甲磺酸乙酯基因毒性雜質(zhì)[J].廣東化工,2017,44(20):210-211.
[4]Quirke J M E, Adams C L, Berkel G J V. Chemical Derivatization for Electrospray Ionization Mass Spectrometry. 1. Alkyl Halides, Alcohols, Phenols, Thiols, and Amines[J]. Analytical Chemistry, 1994, 66(8):1302-1315.
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[6]裴繼影,侯壯豪.質(zhì)譜電噴霧離子源中電化學(xué)與電暈放電氧化還原反應(yīng)的研究進展[J].分析測試學(xué)報,2018,37(12):1508-1513.
[7]Ma X，Xia Y．Pinpointing Double Bonds in Lipids by Paternò-Büchi Reactions and Mass Spectrometry[J]．Angewandte Chemie International Edition，2014，53(10)：2592-2596．
作者簡介：@roger，廣東廣州人，碩士研究生，工程師，主要研究方向為分析方法學(xué)，儀器原理與研制，凝聚態(tài)物理，電學(xué)理論與超導(dǎo)體理論，理論物理等等。
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