2023年4月6日，國家藥典委員會官網(wǎng)發(fā)布"關(guān)于通則0541電泳法第五法SDS-聚丙烯酷胺凝膠電泳法草案的公示"，擬對2020年版《中國藥典》第三部第463頁暨第四部第69頁收入的方法--0541電泳法第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法部分內(nèi)容進行修訂，公示期自發(fā)布之日起3個月。說起電泳法，常見用于分析蛋白質(zhì)和核酸等混合物分離的技術(shù)，它主要的目的是用于分析而非制備，主要應(yīng)用領(lǐng)域是生物和生化研究、蛋白質(zhì)化學、臨床研究等領(lǐng)域。
一、了解電泳法常用專業(yè)術(shù)語
1. 電泳：
是指溶解或懸浮于電解液中的帶電荷的蛋白質(zhì)、膠體、大分子或其他粒子，在電流作用下向其自身所帶電荷相反的電極方向遷移。
2. 電泳法：
是指利用溶液中帶有不同量電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中使供試品組分以不同的遷移速度向?qū)?yīng)的電極移動，實現(xiàn)分離并通過適宜的檢測方法記錄或計算，達到測定目的的分析方法。
3. 移動界面電泳：
也稱自由溶液電泳是指不含支持物的電泳，溶質(zhì)在自由溶液中泳動，適用于高分子的檢測。
4. 區(qū)帶電泳：
是指含有支持介質(zhì)的電泳，帶電荷的供試品（如蛋白質(zhì)、核苷酸等大分子或其他粒子）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，向其極性相反的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶。
5. 相對遷移率：
供試品和對照品/標準品的電泳區(qū)帶有時可用相對遷移率（R'm）進行比較。其計算式如下：
6. 兩性電解質(zhì)：
是指既能當酸又能當堿用的電解質(zhì)。兩性電解質(zhì)通常為兩性元素的氧化物的水合物、氨基酸等。
二、常見的電泳分析方法，你知道幾種？
2020年版《中國藥典》0541電泳法收載了六種常用的電泳法分類，分別是：
1) 第一法，紙電泳法；
2) 第二法，醋酸纖維素薄膜電泳法；
3) 第三法，瓊脂糖凝膠電泳法；
4) 第四法，聚丙烯酰胺凝膠電泳法；
5) 第五法，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE法)；
6) 第六法，等電聚焦電泳法。
那么以上六種電泳分析方法的主要區(qū)別，梳理如下表所示：
三、新舊第五法，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE法)對照看
第五法，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE法)包括四部分內(nèi)容，分別為1.儀器裝置、2.試劑、3.測定法、4.結(jié)果判定，其中【2.試劑鑒別】、【4.結(jié)果判定】項下有發(fā)生變化，涉及標準項目變更對照如下表所示：
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項目/編號 |
《中國藥典》2020年版 |
《中國藥典》2025年擬修訂版 |
變更解讀 |
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2試劑 （9）非還原型供試品緩沖液（4×) |
稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g，溴酚藍20mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至約80ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml。 |
稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g，溴酚藍80mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至約80ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml。 |
溴酚藍，是一種有機化合物，分子式為C19H10Br4O5S，分子量為669.961，淺黃色到棕黃色粉末；易溶于氫氧化鈉溶液，溶于甲醇、乙醇和苯，微溶于水，最大吸收波長422nm。 常用做電泳指示染料，凝膠中電泳遷移速度在小分子核酸或蛋白質(zhì)區(qū)域。 |
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2試劑 （10）還原型供試品緩沖液（4×) |
稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g、溴酚藍20mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至約80ml，加入β-巰基乙醇20ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml（或稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g、溴酚藍20mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至80ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml。在使用前，加入二硫蘇糖醇至100mmol/L）。 |
稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g、溴酚藍80mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至約80ml，加入β-巰基乙醇20ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml（或稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g、溴酚藍80mg、十二烷基硫酸鈉8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀釋至80ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至100ml。在使用前，加入二硫蘇糖醇至100mmol/L）。 |
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4結(jié)果判定
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凝膠顯色處理完畢后，對其進行拍 照或掃描，通常用商品化的帶有數(shù)據(jù)分析軟件的凝膠掃描系統(tǒng)進行拍照和分析，得到相對遷移率值或以其他形式如分子量等體現(xiàn)的相對遷移率。每條譜帶距分離膠頂部的距離為遷移距離，將每條蛋白質(zhì)譜帶的遷移距離除以染料前沿的遷移距離，即為蛋白的相對遷移率， 計算公式如下：相對遷移率（Rm）＝蛋 白遷移距離/溴酚藍指示劑遷移距離 然后根據(jù)需要進行以下結(jié)果分析。 |
凝膠顯色處理完畢后，對其進行拍照或掃描，通常用商品化的帶有數(shù)據(jù)分析軟件的凝膠掃描系統(tǒng)進行拍照和分析，得到相對遷移率值或以其他形式如分子量等體現(xiàn)的相對遷移率。每條譜帶距分離膠頂部的距離為遷移距離，將每條蛋白質(zhì)譜帶的遷移距離除以染料前沿的遷移距離，即為蛋白的相對遷移率，計算公式如下：相對遷移率（Rm）＝蛋白遷移距離/溴酚藍指示劑遷移距離 然后根據(jù)需要進行以下結(jié)果分析。如有必要，可采用適宜方法，將凝膠進行干膠處理、保存。 |
為了便于電泳檢驗結(jié)果的可追溯性，一般電泳后，可采用適宜方法，將凝膠進行干膠處理、保存 |
參考文獻
[1] www.chp.org.cn
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