按照WHO專家的話說，的風險就是患者有病卻沒有治療藥品。但是，如果有研發(fā)人員開發(fā)了藥品，但是要限于目前保守的法規(guī)質控要求，不能及時讓患者獲得救命藥品，也是非常遺憾的。長期以來，各國藥典收載了很多評估藥品成品和原輔料的微生物檢測方法；這些方法為客觀評價藥品品質，并協(xié)助制藥人員和監(jiān)管人員以判斷藥品質量發(fā)揮了很大的作用。但是目前從最新觀點看，大部分藥典收載的微生物檢測反復都是保守和滯后的，因為這些檢測方法需要很長時間才可以給出最后檢測結果。拿無菌檢測為例，目前世界各國藥典都規(guī)定無菌藥品要培養(yǎng)14天，而這個培養(yǎng)時間對于很多癌癥晚期患者而言，是非常難以忍受的煎熬。另外，有些藥品有效期很短，例如電子輻射類藥物；如果對于這些藥品都采用常規(guī)微生物檢測方法來判斷和實施放行，患者和制藥行業(yè)都要承受痛苦。

       為了解決這些矛盾，各國技術專家不斷開發(fā)和推出快速微生物檢測技術（RMM）。目前，USP推出一個新的技術附錄，詳細闡釋了對于效期較短的無菌藥品，如何做才是更合理的。這份文件的名稱是USP-1071《RAPID MICROBIAL TESTS FOR RELEASE OF STERILE SHORTLIFE PRODUCTS: A RISK-BASED APPROACH》，翻譯中文為《有效期較短的無菌產(chǎn)品放行的快速微生物測試-基于風險的方法》。

       筆者根據(jù)自己的理解，對全文進行了翻譯和解析，希望可以為制藥行業(yè)以及亟待救命藥的患者提供幫助。

       1 介紹

       人們普遍認為，目前生長型的無菌檢查法（培養(yǎng)期至少為14天）（見無菌檢查〈71〉）不適用于效期較短的產(chǎn)品或準備立即使用的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品通常在檢測完成前注入患者體內(nèi)。這些短效期產(chǎn)品包括調配無菌制劑（CSP）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）產(chǎn)品以及細胞和基因療法產(chǎn)品，它們需要新一代的基于風險的方法，包括快速微生物測試。有關無菌檢查以外有助于無菌保證因素的一般討論，請參見無菌保證〈1211〉。應注意的是，與其他替代測試方法一樣，如果發(fā)生爭議，仲裁采用的測試方法應該符合USP〈71〉所列方法。

       如果進行微生物檢測，在產(chǎn)品使用前完成檢測微生物污染的測試來確?；颊叩陌踩?/p>

       快速微生物檢測（RMTs）應基于風險，這樣利益相關者可選擇適合其預期用途的首選技術，并平衡用戶需求規(guī)范（URS），包括出結果時間、特異性、檢測限（LOD）、樣本量和產(chǎn)品屬性。例如，許多**藥物，由于**示蹤劑的半衰期短，通過實時微生物檢測受益最多，而調配無菌制劑（CSPs）和細胞治療產(chǎn)品，由于會稍微超過使用日期，因此采用通宵檢測或至少在48小時內(nèi)完成檢測會使用戶受益。

       本章節(jié)是一般性信息，討論了生產(chǎn)/制備和檢測短效期產(chǎn)品的需求及其URS，并簡要討論了短效期的無菌產(chǎn)品放行的基于風險的快速微生物檢測的一些合適方法（本章下文稱為"短效期產(chǎn)品"）。

       2 無菌短效期產(chǎn)品放行的快速微生物測試的用戶要求規(guī)范

       短效期產(chǎn)品放行進行快速微生物測試選擇合適的技術應該是基于風險的決定。不同技術的URS包括：

       o用盡可能短的時間產(chǎn)生檢測結果，是實時的或少于24小時，是在產(chǎn)品給藥之前

       o檢測能力，在測試樣品中檢測到少于100CFU

       o能夠在產(chǎn)品中檢測多種活性微生物

       o樣本數(shù)量,即測試物品的最小數(shù)量和每個測試容器的數(shù)量，不會用完大部分的可用產(chǎn)品；

       在可行的情況下，制造商應在工藝設計過程中考慮檢測要求

       o無菌測試材料處理，即封閉系統(tǒng)，以減少測試過程中的意外污染

       o可從多個供應商獲得儀器和試劑

       o參考標準、陰性和陽性對照的可用性，適用于使用菌落形成單位以外信號的技術。

       o易于使用/測試和數(shù)據(jù)解釋簡單

       o假陽性和假陰性結果的發(fā)生率較低

       o針對每個特定產(chǎn)品的方法適用性測試策略

       o提高患者的安全性，主要在于：

       在給藥前完成測試

       提供無菌檢測不合格的逐步監(jiān)測和報告的測試

       o能夠識別檢測到的微生物，這可能對臨床醫(yī)生用藥以及調查確定其來源有用。

       o測試中使用的設備和試劑的耐用性和可靠性

       o樣品制備適用于手動和自動方法

       3 基于風險的微生物監(jiān)測和放行測試的概念

       對快速微生物檢測（RMT）的URS的審查表明，需要做出一些基于風險的決定，特別是在出結果的時間、LOD、樣本量以及檢測到的微生物范圍方面，以便在給藥前采用此類檢測。如果現(xiàn)行的無菌檢查不合適，利益相關者應進行風險評估以選擇RMT。

       受益的方面可能包括，例如：

       o當產(chǎn)品給藥太晚對患者生存存在重大風險的情況下使用RMT。臨床文獻中的一個顯著例子是血液感染，這是一種快速進行性感染，死亡率高達40%，并且每天延遲服用抗生素會導致死亡率增加10%。在這些情況下，在給藥前完成微生物測試顯然可以提高患者的安全性。

       o采用生長型的RMT，將連續(xù)讀數(shù)應用于"到目前為止為陰性"的風險放行，因為可以更早地檢測到快速生長的微生物，如果檢測到不合格，這樣讓臨床醫(yī)生能夠更快地對患者進行干預。當檢測到被污染的產(chǎn)品時，實驗室主管可以通知治療患者的臨床醫(yī)生，并可以開始血管內(nèi)液體復蘇和抗生素治療以避免感染性休克。因此，與培養(yǎng)期結束時的單個讀數(shù)相比，逐步監(jiān)測并自動報告不合格的無菌測試具有額外的優(yōu)勢。

       o使用LOD高于1 cfu的非生長型RMT，通過微生物培養(yǎng)基中的生長進行擴增，但產(chǎn)生結果的時間非?？?。短效期產(chǎn)品在給藥之前實時檢測污染的能力可能會認為比在產(chǎn)品中檢測單個菌落形成單元更重要。當考慮到對患者的風險時，RMT的選擇應考慮到檢測靈敏度與檢測時間的關系。分析應有合理的靈敏度，以檢測低水平污染物的存在，并應在產(chǎn)品給藥前可獲得結果的時間框架內(nèi)進行。

       o非生長型RMT方法的其他優(yōu)點還可能包括不受測試樣品中抗生素的影響，以及檢測培養(yǎng)陰性感染因子。一些DNA靶向抗生素（如多粘菌素B和桿菌肽）已被證實抑制了PCR擴增，而青霉素G、氯霉素、兩性霉素和納利地西酸等抗生素不影響反應的分辨能力。這對于生產(chǎn)抗生素注射溶液的無菌配制藥房來說是最重要的。方法適用性應確定供試品中是否有抗生素會影響測定。

       此外，在最終產(chǎn)品放行無菌檢查之前，可將RMTS或其他快速微生物方法（RMMs）用于中控之中，以更快地提供有關微生物控制的有效性和對總污染的早期檢測的信息（以便調查和盡快啟動生產(chǎn)）或產(chǎn)品可能無菌不合格的可能性。

       對于風險評估，一個可能被忽視的考慮因素是根據(jù)注射或注入的產(chǎn)品的數(shù)量和給藥部位對病人的相對風險。注入體積越大，侵入性越強，患者的血流感染風險就越大。風險范圍從少量的皮內(nèi)注射到大量的靜脈注射(見表1)。

       表1. 按給藥途徑和相對風險水平劃分的典型注射量

       4 用于確定無菌短效期產(chǎn)品放行的基于風險的快速微生物試驗的關鍵操作參數(shù)

       預計的操作參數(shù)，即表2中列出的適用于RMT的備選技術的LOD、出結果的時間以及樣本量。

       表2 備選的快速微生物技術的操作參數(shù)

       對于這些方法，信號將以基因組單位表示。

       5 〈71〉不適用于產(chǎn)品放行檢測時樣本大小的考慮

       根據(jù)技術的樣品處理能力或保存急需產(chǎn)品的需要，可能需要縮減樣本大小。

       每種培養(yǎng)基所使用的產(chǎn)品的最小數(shù)量以及與批量相關的待測單元的最小數(shù)量見< 71 >，表2和表3。人們普遍認為，對于大批量的制藥產(chǎn)品，檢測的單位數(shù)量并不是基于統(tǒng)計的，而且在每個產(chǎn)品批次中檢測低污染水平的能力較低。然而，隨著許多效期較短的產(chǎn)品的批量變小，這一限制將會減少，因為測試的產(chǎn)品相對于批量的比例將會增加。

       這種傳統(tǒng)的取樣計劃不適用于細胞治療產(chǎn)品。例如，如果準備了10個單獨的60毫升的靜脈注射（IV）細胞袋，那么將取4個樣品袋，每個樣品袋取20毫升。采用這種抽樣方案，40%的批次將被用于無菌檢查，這不僅是巨大的經(jīng)濟損失，而且更重要的是，治療產(chǎn)品的巨大損失，可能會影響對患者的足量給藥劑量。相反，如果40個1毫升的西林瓶用于注射用藥品4萬瓶批次的無菌檢查，這只占該批次的0.1%。

       減少樣本量和檢測單位數(shù)量將降低無菌檢查的靈敏性。表3和表4說明了對藥品和調配無菌制劑（CSP）測試的相對不敏感性。

       表3 藥品20單位的無菌檢查通過給定的不斷增加的污染率的概率

       根據(jù)以下進行計算

       p = (1 - p)²⁰ = q²⁰

       p = 批次中污染的比例

       q = 批次中未污染的比例

       表4 無菌調配制劑（CSP）6單位的無菌檢查通過給定的不斷增加的污染率的概率

       其他藥典中也提出了替代的抽樣計劃。歐洲藥典9.0章第2.6.27細胞制劑微生物學檢查中發(fā)現(xiàn)了一種批量小于40個單位的細胞治療產(chǎn)品無菌檢查的推薦方法。

       容量在10 ~ 1000ml的細胞制劑的污染試驗樣品量為總容量的1%;容量在1 ~ 10ml的細胞制劑，樣品量為0.1 mL;對于小于1ml的細胞制劑，該制劑將不進行檢測。如21 CFR 610.12(無菌)中所建議的，在完全合理的情況下，可使用快速方法進行中控檢測，以代替最終產(chǎn)品檢測。

       與細胞治療制劑類似，PET**藥物的樣品量和采樣計劃也必須適應有限的瓶數(shù)(通常為一個)和批次中生產(chǎn)的產(chǎn)品容量(通常小于15毫升)。如果該批次由單個容器組成，則無菌檢查樣品量至少為該批次總容量的1%。例如，如果一個批次是1瓶含有15毫升，至少使用0.15毫升用于無菌檢查。如果該批次由多個容器組成，則使用單個容器的量至少占整個批次容量的1%。如果每批由3個小瓶組成，每個小瓶含有25毫升，則至少從1小瓶中取0.75毫升用于無菌檢查。

       檢測限

       在用一個或多個菌落形成單元的細胞懸浮液制備接種物的限制條件下，生長型的無菌檢查顯示根據(jù)泊松分布理論檢出限至少為1-3 cfu。對所有技術設置單個活細胞的LOD，對于任何無菌檢查方法來說都是設置了不切實際的使用障礙，尤其是當信號不是通過培養(yǎng)的濃縮而放大的菌落形成單元時。

       檢測多種微生物的能力

       盡管所有的分析平臺都應能夠檢測各種各樣的細菌、酵母菌和霉菌，但證實快速微生物檢測（RMT）選擇的技術能夠檢測與無菌檢查不合格、爆發(fā)感染以及與CSP、**藥物、細胞療法或制劑相關的產(chǎn)品召回有關的微生物，這一點是非常重要的。風險分析后，如果該技術顯示能夠通過向獨立利益相關患者給藥，并提高患者的安全性，則情況尤其如此。

       6 無菌短效期產(chǎn)品放行快速微生物檢測方法

       根據(jù)與上文討論的URS的匹配情況，適用于RMT推薦的技術，按字母順序列出如下：

       o三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光

       o流式細胞術

       o恒溫微量熱量測定法

       o核酸擴增

       o呼吸

       o固相細胞術

       技術簡介

       分別對這些備選的高級分析平臺進行了簡要討論，并提供了關鍵參考。有關概述，請參閱Moldenhauer

       三磷酸腺苷生物發(fā)光

       這是一項成熟的技術，有多種儀器制造商提供的光度計和試劑?；罴毎哪芰恳訟TP的形式儲存，當接觸美國螢火蟲的熒光素酶時，可以以光的形式測量。熒光素酶消耗的每個ATP分子產(chǎn)生一個光子。

       光度計檢測到的結果通常以相對光單位（RLU）表示，并且結果依賴儀器、試劑和有機體。不同微生物的ATP含量范圍為革蘭氏陰性菌2～4×10～18摩爾/cfu，革蘭氏陽性菌5～8×10～18摩爾/cfu，真菌300～800×10～18摩爾/cfu。在微生物培養(yǎng)基中，由于測量的高信噪比和背景ATP，肉湯中微生物相關儀器的檢測限約為5000 RLU，相當于約10 ³ CFU。

       這一LOD將檢測微生物的存在，其水平與目視檢測培養(yǎng)基生長所需的水平相比，低3-4個對數(shù)水平。無菌短效期產(chǎn)品放行的快速微生物試驗，無論是在液體培養(yǎng)基中達到閾值ATP水平的濃縮培養(yǎng)，還是在固體培養(yǎng)基上的膜過濾器上形成微生物菌落的濃縮培養(yǎng)，培養(yǎng)時間均可達到2-7天。

       流式細胞術

       流式細胞術可用于在24-48 h的濃縮培養(yǎng)后檢測熒光標記的活菌細胞。標記試劑由熒光基質或活菌染色劑組成，用于區(qū)分活細胞與死細胞和細胞碎片。雖然細菌非常小，可能很難從細胞碎片中區(qū)分出來，但它們可以通過大小、形狀和熒光強度來區(qū)分。細胞存活能力是指完整的細胞膜保留由非特異性細胞酯酶產(chǎn)生的熒光色素的能力，或用核酸特異性生命染色標記細胞。激光照射流中的每個細胞以及發(fā)出的光由雙光電倍增管陣列檢測。信號經(jīng)過數(shù)字化處理，并由識別軟件進行解釋。該技術的LOD可能是>1 cfu并且可能需要一個濃縮步驟。

       恒溫微熱量計

       恒溫微熱量計監(jiān)測與微生物代謝活性和生長有關的密閉小瓶（系統(tǒng)）的焓變化。利用現(xiàn)有的儀器，10⁴個活性微生物細胞可以釋放足夠的熱量進行檢測并且檢測需要濃縮（出結果需2-7天）。盡管其在無菌產(chǎn)品放行測試中的具體應用尚未確定，但最近它在藥物微生物學中的應用已經(jīng)得到了評估。

       核酸擴增技術

       實時定量聚合酶鏈反應（PCR）有可能通過36-48個擴增周期監(jiān)測PCR的指數(shù)階段，使用通用引物和探針（稱為"泛細菌"和"泛真菌"方法）估計目標DNA的初始數(shù)量，即反過來，與試驗樣品中微生物細胞的數(shù)量成比例。與DNA不同的是，細胞RNA的代謝速度很快，可以更好地指示活的微生物。

       例如，大腸桿菌每個細胞含有2個DNA分子和2×10⁴個16S rRNA分子。這一過程是通過酶逆轉錄酶將RNA轉化為DNA（cDNA）的互補拷貝來實現(xiàn)的，cDNA可以通過定量（計數(shù)試驗）或定性（無菌檢查）實時分析?；蛘?，對于基于DNA的PCR，用單疊氮化物或單疊氮化物丙啶預處理的樣品也可以提供區(qū)分活的和死的微生物細胞的能力，或者可以通過離心/洗滌步驟從試驗樣品中去除游離的微生物DNA，包括從分析用細菌顆粒中去除游離的微生物DNA。

       實際上，單個活細胞的LOD可能是一個不可克服的挑戰(zhàn)，尤其是對于依賴DNA/RNA靶和通用性引物的測試而言。

       另一個挑戰(zhàn)是不同微生物中不同數(shù)量的基因組物質。

       一般情況下，LOD在樣本中范圍為10到1000個活細胞/mL，另外在一些報告病例中范圍為10到100個活細胞/mL。最近的研究表明，PCR實際上可以在不需要在微生物生長培養(yǎng)基中預培養(yǎng)的情況下，在含有高達10個哺乳動物細胞/mL的高濃度樣品中檢測到10 - 10 cfu/mL的微生物。增加生長型的濃縮步驟至少24-48 h并且比較培養(yǎng)前后PCR結果，可為無菌檢查提供實用的解決方案。

       另外，還可以采用濃度法來富集樣品，減少樣本體積。如上所述的最近的一項研究的作者使用16 s rRNA PCR對干細胞進行無菌檢查,證明細菌靈敏度為10 - 100 cfu / mL,測試方法靈敏度100 cfu /毫升將適合檢測臨床顯著細菌污染的血液和細胞制品。

       生長型和核酸擴增型檢測方法的直接比較是復雜的，因為核酸擴增型檢測方法也檢測非活性的生物體，而且是對微生物基因組拷貝數(shù)的測量，而不是菌落形成單位。因此，核酸擴增型檢測LOD應根據(jù)每毫升基因組當量來定義。

       用于無菌短效期產(chǎn)品（如核酸擴增）放行的非生長型RMT由于以下原因可能具有其他優(yōu)勢：

       o接近實時的檢測，將在短效期產(chǎn)品注入患者體內(nèi)前完成檢測

       o檢測培養(yǎng)陰性感染因子

       o如本章前面所述，測試樣本中抗生素對測試的影響最小

       o與其他技術相比，該測試對動物細胞裂解(如顆粒、ATP)產(chǎn)生的背景不太敏感，因為特定的微生物基因是靶向的

       呼吸類技術

       這一大類包括從經(jīng)典呼吸計，到氣體頂空分析儀，再到自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)。好氧和厭氧肉湯配方考慮到了5天的培養(yǎng)時間內(nèi)可以回收引起血流感染的大多數(shù)微生物的回收率。在一些儀器中，這包括如〈71〉中20°-25°和30°-35°的培養(yǎng)。這項技術已經(jīng)成功地擴展到細胞治療產(chǎn)品的無菌檢查，采用7天的培養(yǎng)作為批次放行藥典無菌檢查的替代方法。

       其他可用于檢測和計數(shù)呼吸微生物的儀器。例如，可調諧二極管激光吸收光譜（TDLAS）可以測量培養(yǎng)基中含有生長微生物的封閉單元中的氧（O）消耗或二氧化碳（CO）增加。該技術最初是為監(jiān)測密閉裝置中的氣體頂空成分而開發(fā)的，也可用于自動介質填充檢查。系統(tǒng)具有氣體校準標準，如果系統(tǒng)用于無菌檢查（例如，對大容量容器進行校準），則需要進行較小的調整。

       [注：呼吸平臺的所有系統(tǒng)都需要微生物生長和代謝活性進行檢測，即通常需要2-7天的時間才能獲得結果。但是，如果結果可以逐步監(jiān)測，在培養(yǎng)期間早先檢測到無菌檢查不合格，這對于上述風險評估部分所述的短效期產(chǎn)品是一個巨大的優(yōu)勢。]

       固相細胞術

       有基于固相細胞術的儀器系統(tǒng)，結合熒光標記和固相激光掃描，可快速計數(shù)可過濾液體中的活微生物。通過過濾0.45微米聚酯膜收集微生物，并用背景和活性染料進行處理。用高速488nm氬激光在細胞儀中掃描濾光片。多個光電倍增管，經(jīng)過處理以區(qū)分標記微生物和背景噪聲，根據(jù)大小、形狀和熒光強度，檢測熒光。掃描顯示為一張地圖，用于識別熒光事件的位置，使用帶自動機動化臺的表觀熒光顯微鏡來確定單個事件的位置。該系統(tǒng)聲稱能在2-3小時內(nèi)檢測到單個的活微生物。應該注意的是，大多數(shù)細胞治療產(chǎn)品都是不可過濾的，因此該技術可能與這些類型的產(chǎn)品不兼容。

       7 方法適用性測試

       生長型無菌試驗的方法適用性要求見〈71〉。必須要證明每個待測試產(chǎn)品的測試適用性。在殘留產(chǎn)品存在的情況下，USP在低于100 cfu的水平上挑戰(zhàn)生物體的回收率，被證明為直接接種或膜過濾法的微生物生長介質中明顯可見生長。除了源自實驗室的菌落形成單元以外的信號培養(yǎng)（例如，核酸、ATP和活微生物細胞的熒光標記），測試實際樣品的結果可能會得出與使用其他技術不相同的結果。然而，方法適用性測試將確認分析物中的產(chǎn)品殘留物不會抑制與快速方法產(chǎn)生信號相關的酶促步驟。

       8-術語（省略）

       9-參考文獻（省略）

       作者簡介：zhulikou431，高級工程師、PDA會員、ISPE會員、ECA會員、PQRI會員、資深無菌GMP專家，在無菌工藝開發(fā)和驗證、藥品研發(fā)和注冊、CTD文件撰寫和審核、法規(guī)審計、國際認證、國際注冊、質量體系建設與維護領域，以及無菌檢驗、環(huán)境監(jiān)控等領域皆具有較深造詣。近幾年開始著力關注制藥宏觀領域趨勢分析和制藥企業(yè)并購項目的風險管理工作。