Cell：高璞/高光俠/張立國團隊揭示EB病毒致癌蛋白LMP1的組裝與激活機制

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來源：生物世界

2024-07-12

研究發(fā)現(xiàn)，LMP1以一種全新且與此前猜測完全不同的機制進行寡聚自組裝，并通過巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號活化。另外，研究中發(fā)現(xiàn)的新機制和新界面，也為此前一些不清楚的現(xiàn)象提供了精確解釋，并有望直接助力LMP1靶向干預(yù)策略的開發(fā)。

愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）是一種人類皰疹病毒，也是首個報道的人類腫瘤病毒，全球約95%的成人經(jīng)歷過感染并終生攜帶EBV。雖然通常不產(chǎn)生嚴(yán)重癥狀，但EBV感染也有幾率導(dǎo)致多種淋巴癌和上皮細胞癌，如鼻咽癌、霍奇金淋巴癌、伯基特淋巴癌、胃癌等。EBV相關(guān)癌癥約占全球人類癌癥負(fù)擔(dān)的1.9%，每年導(dǎo)致約35萬新增癌癥病例，對人類生命健康產(chǎn)生巨大威脅。

潛伏期膜蛋白1（Latent Membrane Protein 1，LMP1）是EBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白。1985年，Elliott Kieff團隊首次報道LMP1單一蛋白表達即能誘發(fā)B細胞的永生化，后續(xù)研究也相繼發(fā)現(xiàn)LMP1通過模擬CD40信號參與B細胞和上皮細胞增殖和早期癌變。而與CD40不同，LMP1信號的激活不依賴任何配體，且LMP1介導(dǎo)的信號強度顯著強于CD40。除了介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化和永生化，LMP1還參與調(diào)控多種重要生命活動，包括免疫應(yīng)答（如核酸免疫通路、干擾素通路、細胞免疫等）、細胞因子和趨化因子分泌、細胞凋亡、細胞遷移、細胞互作、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。鑒于LMP1與EBV致病的高度關(guān)聯(lián)性，以及LMP1在EBV相關(guān)惡性腫瘤中的廣泛表達和分布，LMP1一直被認(rèn)為是EBV陽性腫瘤鑒別診斷和靶向治療的理想靶點。

盡管目前對LMP1介導(dǎo)的下游功能有了較多認(rèn)識，然而作為產(chǎn)生多樣性功能的核心前提——即LMP1如何實現(xiàn)配體不依賴的組裝和激活，仍然是困擾領(lǐng)域近40年的難題，也是影響LMP1靶向干預(yù)策略成功開發(fā)的重要阻礙。

2024年7月11日，中國科學(xué)院生物物理所高璞、高光俠、張立國合作團隊在 Cell 期刊發(fā)表了題為：Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1 的研究論文，該團隊經(jīng)過6年多的科研攻關(guān)，揭開了EBV關(guān)鍵致癌蛋白LMP1自組裝和組成性激活的神秘面紗。

該研究發(fā)現(xiàn)，LMP1以一種全新且與此前猜測完全不同的機制進行寡聚自組裝，并通過巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號活化。另外，研究中發(fā)現(xiàn)的新機制和新界面，也為此前一些不清楚的現(xiàn)象提供了精確解釋，并有望直接助力LMP1靶向干預(yù)策略的開發(fā)。

Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1 研究論文

研究團隊首先利用共聚焦顯微鏡進行細胞成像，發(fā)現(xiàn)LMP1在生理表達水平下會在膜上呈現(xiàn)為明顯的聚集形態(tài)。進一步的超分辨成像表明，LMP1的聚集是一種寬度較為固定但長度不均一的細條狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明LMP1可在膜上組裝成有趣的聚集，但其分子層面的細節(jié)仍不清楚。

為回答這一問題，研究團隊計劃解析LMP1在不同組裝狀態(tài)下的精細結(jié)構(gòu)。然而，這一目標(biāo)在過去近40年的研究中已被證明非常具有挑戰(zhàn)性，主要是因為：1）性質(zhì)良好的LMP1蛋白很難大量制備；2）LMP1核心跨膜區(qū)僅~20 KDa，且?guī)缀鯚o可識別的穩(wěn)定水溶區(qū)。

經(jīng)過大量嘗試，研究團隊解決了LMP1難表達、難純化的問題，生化分析也提示LMP1在溶液中存在不同聚集狀態(tài)。為輔助結(jié)構(gòu)解析，研究團隊進一步開展了系統(tǒng)性LMP1抗體篩選，獲得了能夠穩(wěn)定結(jié)合LMP1跨膜區(qū)的鼠源單抗。通過抗體輔助策略，研究團隊成功解析了LMP1兩種意想不到的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)：軸對稱二聚體和filament狀高聚體。LMP1單體以一種全新的方式進行跨膜區(qū)折疊，進而通過反向平行疊合形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)；LMP1二聚體是其進行更高級組裝的基本單元，多個二聚體以“side-by-side”方式自組裝形成filament狀高聚結(jié)構(gòu)。重要的是，這些高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，恰好符合活細胞成像所觀測到的獨特聚集形態(tài)，從而在不同分辨率尺度上揭示了LMP1的膜上聚集機制。

值得一提的是，由于目前PDB數(shù)據(jù)庫中尚無任何LMP1的同源結(jié)構(gòu)，LMP1多種狀態(tài)（單體、二體及寡聚體）的真實結(jié)構(gòu)均與AlphaFold2/3等工具的預(yù)測結(jié)果完全不同。而且，這種不同不僅體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)折疊的巨大差異，更為嚴(yán)重的是預(yù)測結(jié)果的基本拓?fù)鋵W(xué)走向也完全錯誤。這提示在沒有同源結(jié)構(gòu)訓(xùn)練的情況下，我們對預(yù)測結(jié)構(gòu)的使用需格外謹(jǐn)慎。從另一個角度來說，該研究中獲得的LMP1多種聚集狀態(tài)的真實結(jié)構(gòu)，也為后續(xù)預(yù)測訓(xùn)練提供了全新且獨立的折疊方式及組裝模式。

LMP1在膜上的組裝和聚集

為進一步明確LMP1的功能形式，研究團隊對二聚體和寡聚體界面分別進行了系統(tǒng)突變，發(fā)現(xiàn)其均會破壞LMP1在活細胞中的膜聚集形態(tài)，且均能阻斷下游信號通路活化。這既證明了LMP1分子間互作的重要性，也明確了LMP1的寡聚filament結(jié)構(gòu)才是其真正的激活狀態(tài)。超分辨成像結(jié)果表明，LMP1在膜上的自發(fā)filament狀聚集可包含幾十至數(shù)百個LMP1二聚體單元。LMP1的這種聚集在很低蛋白水平下即可發(fā)生，且隨著LMP1含量增加，多聚體的數(shù)量、強度和長度均呈現(xiàn)顯著增長。這也是首次在較低表達水平下（類似病毒感染的表達水平），系統(tǒng)性觀察到LMP1在膜上的超分辨動態(tài)聚集和組裝。

有趣的是，作為LMP1的功能相關(guān)蛋白，宿主膜受體CD40的激活需依賴其配體介導(dǎo)的三聚體組裝；而且，LMP1和CD40共同的下游信號因子TRAF蛋白，也是以三聚體形式發(fā)揮功能。因此，長期以來領(lǐng)域里普遍推測LMP1也應(yīng)該是采用三聚體的方式來組裝，這樣才能更好的與下游因子進行銜接。而LMP1卻是以二聚體為單元進行“side-by-side”方式的filament自組裝，那么其是如何有效協(xié)調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的呢？

研究團隊通過細致分析，發(fā)現(xiàn)二聚體單元中的兩個LMP1的C端，可以和鄰近二聚體中一個LMP1的C端，在空間上呈現(xiàn)近似等邊三角行的巧妙排列。由于C端延伸的水溶區(qū)負(fù)責(zé)招募下游因子，因此這種filament自組裝方式，結(jié)構(gòu)上等價于多個LMP1“三聚體”平行密集排列，從而能夠比CD40更高效招募下游因子和進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此前研究也證實，如果將CD40 負(fù)責(zé)下游因子招募的C端水溶區(qū)連接到LMP1的跨膜區(qū)上，那么這種嵌合體蛋白的信號激活能力要顯著強于原始的CD40。同時，研究團隊也通過生化手段在體外重組了LMP1與TRAF復(fù)合體，利用電鏡直接觀察到LMP1的filament聚集確實可以同時招募多對TRAF三聚體。LMP1這種多位點且組成性的下游蛋白招募、激活方式，極大促進了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強度，并有效維系了持續(xù)的增殖、癌變信號。