靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）已經(jīng)被確立為一種可行的替代方法，可以在生物學(xué)和臨床環(huán)境中減弱特定蛋白的功能。獨(dú)特的TPD作用模式使以前不可藥物的蛋白質(zhì)成為可行的靶標(biāo)，擴(kuò)大了可藥物特性和特權(quán)靶標(biāo)蛋白質(zhì)的范圍。

       隨著TPD的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了一系列不依賴于募集E3泛素連接酶的創(chuàng)新策略，包括自噬系固化合物（ATTEC）、溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）、自噬靶向嵌合體（AUTOTAC）、細(xì)胞因子受體靶向嵌合體（KineTAC）、整合素促進(jìn)的溶酶體降解（IFLD）和樹突狀DNA嵌合體（DENTAC），已經(jīng)被開發(fā)出來，通過溶酶體運(yùn)輸受體、生長(zhǎng)吞噬體上的LC3-II或寡聚的SQSTM1來劫持內(nèi)源性溶酶體（圖1）。

       這些工具有效地降解細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外和膜蛋白、蛋白質(zhì)聚集體、脂滴和受損的細(xì)胞器。此外，研究表明，病理蛋白可以直接被募集到26S蛋白酶體上，并受到小分子的誘導(dǎo)蛋白水解，例如最近開發(fā)的化學(xué)降解誘導(dǎo)劑（CIDEs）和泛素化獨(dú)立降解劑（uids）。

       在這里，我們概述了這些直接與溶酶體或蛋白酶體結(jié)合的TPD技術(shù)的最新發(fā)展[1]。

       圖1. 不依賴泛素化過程的TPD策略

       01通過自噬機(jī)制靶向降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器

       自噬栓系化合物（attecs）

       最初的一種不依賴于泛素化的TPD方法被設(shè)計(jì)為利用LC3配體，在自噬的早期階段直接與發(fā)育中的吞噬細(xì)胞相互作用（圖2A），被稱為ATTEC，即一種自噬小體綁定化合物，其結(jié)構(gòu)包含靶蛋白配體、連接子、和LC3 配體三個(gè)部分。ATTEC分子可以直接將目標(biāo)蛋白（POI）和自噬關(guān)鍵蛋白LC3結(jié)合在一起，促進(jìn)目標(biāo)蛋白通過自噬-溶酶體途徑降解[2]。

       復(fù)旦大學(xué)魯伯塤教授團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)性地提出了ATTEC的概念，報(bào)道了一系列可連接突變亨廷頓蛋白（mHTT）和LC3的分子膠化合物。

       實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些化合物可以在細(xì)胞內(nèi)和動(dòng)物模型體內(nèi)將mHTT靶向自噬體并降解 mHTT，而不影響野生型HTT的水平，還可以緩解亨廷頓病的相關(guān)表型[3]。

       靶向自噬嵌合體（AUTOTAC）

       2022年，Yong課題組首次提出AUTOTAC技術(shù)（圖2B）。AUTOTAC是一種異雙功能分子，一端為p62配體，另一端為靶蛋白配體，兩者通過Linker相連。具體作用機(jī)制如下：AUTOTAC與p62和靶蛋白同時(shí)結(jié)合，形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致p62構(gòu)象發(fā)生變化，產(chǎn)生自身寡聚并暴露出LC3（light-chain 3）結(jié)合域，進(jìn)而與LC3結(jié)合，介導(dǎo)底物隔離至自噬小體并通過溶酶體途徑降解。

       基于這一理念，研究人員開發(fā)出多種能夠激活p62的小分子化合物，并且在體外實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)了它們降解可溶性蛋白的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將直接激活p62的小分子化合物與靶向雄激素受體（AR）或雌激素受體β（ERβ）亞基的分子連接在一起，可以導(dǎo)致AR和ERβ通過自噬作用被降解，并且有效抑制它們介導(dǎo)的下游信號(hào)通路[4]。

       圖2.基于自噬的降解物的作用機(jī)制

       02通過內(nèi)溶酶體途徑靶向降解分泌蛋白和膜蛋白

       靶向溶酶體嵌合體（lytac）

       斯坦福大學(xué)的Bertozzi教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種不同的蛋白降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體（LYTACs），為靶向降解細(xì)胞外以及膜結(jié)合蛋白開辟了新的可能（圖3A）。

       研究人員報(bào)告稱，溶酶體靶向嵌合體（LYTACs）是一種雙功能分子，有兩個(gè)結(jié)合域，一端攜帶與細(xì)胞表面跨膜受體CI-M6PR結(jié)合的低聚糖肽基團(tuán)，另一端攜帶一個(gè)與靶蛋白結(jié)合的抗體或小分子。這兩個(gè)結(jié)合域通過一個(gè)化學(xué)linker連接起來。

       后續(xù)經(jīng)研究人員證實(shí)，LYTAC技術(shù)能夠有效降解胞外蛋白和單次跨膜蛋白（如EGFR、PD-L1）[5]。

       整合素促進(jìn)的溶酶體降解（IFLD）和樹突狀DNA嵌合體（DENTAC）

       細(xì)胞外和細(xì)胞膜相關(guān)蛋白占據(jù)了所有基因編碼蛋白質(zhì)的40%左右，其中部分蛋白是導(dǎo)致癌癥、衰老、代謝、免疫等多種疾病的關(guān)鍵因素，是一類重要的藥物作用靶點(diǎn)。

       為了實(shí)現(xiàn)此類蛋白的靶向降解，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院房麗晶教授研究團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種新型整合素促進(jìn)的溶酶體降解（IFLD）策略（圖3B）。將靶蛋白結(jié)合配體與整合素識(shí)別配體相偶聯(lián)，所得到的雙功能化合物能夠以整合素和溶酶體依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞外或細(xì)胞膜蛋白的內(nèi)吞和降解。整合素是細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞粘附受體，在細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。由于整合素αvβ3通常在腫瘤中過表達(dá)，因此該IFLD策略在降解腫瘤相關(guān)蛋白方面極具價(jià)值。

       應(yīng)用這一策略，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)、合成了靶向免疫檢查點(diǎn)PD-L1的雙功能化合物BMS-L1-RGD，并證實(shí)該化合物在細(xì)胞和整體動(dòng)物水平均能夠有效的降解靶標(biāo)蛋白PD-L1，且具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果[6]。

       此外，南京大學(xué)李金波教授團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種樹突狀DNA嵌合體（DENTAC）策略（圖3C），該策略利用SRs進(jìn)行靶向膜蛋白降解，包括POI結(jié)合分子與樹突狀DNA。DENTAC一端為靶蛋白配體，另一端為結(jié)合SR受體的樹枝狀DNA配體。DENTAC同時(shí)與靶蛋白和SR結(jié)合后可誘導(dǎo)靶蛋白溶酶體降解。共價(jià)樹枝狀DNA結(jié)構(gòu)明確，性質(zhì)穩(wěn)定，是SR的通用配體。

       研究發(fā)現(xiàn)DENTAC平臺(tái)可以利用SR介導(dǎo)致癌膜蛋白發(fā)生溶酶體途徑降解，達(dá)到治療腫瘤的目的[7]。

       細(xì)胞因子受體靶向嵌合體（KineTACs）

       美國加州大學(xué)舊金山分校James A. Wells團(tuán)隊(duì)研究報(bào)道了一種溶酶體降解策略，稱為細(xì)胞因子受體靶向嵌合體（KineTACs）（圖3D），可用于定向降解細(xì)胞表面和細(xì)胞外蛋白。KineTAC是完全基因編碼的雙特異性抗體，由結(jié)合其同源細(xì)胞因子受體的細(xì)胞因子臂和目標(biāo)蛋白質(zhì)的靶標(biāo)結(jié)合臂組成。

       研究人員發(fā)現(xiàn)，含有細(xì)胞因子CXCL12的KineTAC可以使用誘餌回收受體CXCR7，將多種靶蛋白靶向到溶酶體進(jìn)行降解。另外的KineTACs被設(shè)計(jì)用來駕馭其他CXCR7靶向細(xì)胞因子，CXCL11和vMIPII，以及白細(xì)胞介素-2（IL-2）受體靶向細(xì)胞因子IL-2。

       因此，KineTAC代表了一種通用的、模塊化的、選擇性的和簡(jiǎn)單的遺傳編碼策略，用于誘導(dǎo)具有廣泛或組織特異性分布的細(xì)胞外和細(xì)胞表面靶標(biāo)的溶酶體遞送[8]。

       圖3.利用配體觸發(fā)受體內(nèi)吞作用的基于溶酶體的降解物

       03通過直接募集26S蛋白酶體的TPD

       降解化學(xué)誘導(dǎo)劑（CIDEs）

       PROTAC分子依然面臨一系列挑戰(zhàn)：分子量過大而難以穿膜的困境；連接子的選擇有限，尚無系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)方法；脫靶毒性；E3連接酶的表達(dá)水平差異；POI可能不是所選E3連接酶的天然/理想底物等。

       有鑒于此，Erin C. Dueber等人提出希望拓展降解化學(xué)誘導(dǎo)劑（CIDEs）的選擇（圖4A），這就是直接將底物引向26S蛋白酶體。26S蛋白酶體在所有細(xì)胞都高表達(dá)，理論上可以擴(kuò)展到任何底物；此外，這種策略使得降解端只需一種配體就足夠通用。機(jī)體本身也天然存在一些不依賴泛素化而直接被蛋白酶體降解的蛋白，如鳥氨酸脫羧酶和胸苷酸合酶[9]。

       研究人員通過實(shí)驗(yàn)也證明了通過直接蛋白酶體募集進(jìn)行降解是靶向蛋白質(zhì)降解的可行策略。

       ADRM1介導(dǎo)的泛素非依賴性降解物（UIDs）

       最近，Kodadek等人提出了一種基于直接參與26S蛋白酶體而不涉及多聚泛素鏈的替代TPD策略。UID系統(tǒng)使用26S蛋白酶體上的另一種泛素化受體ADRM1，由于不存在適合ADRM1的配體，因此使用穩(wěn)定過表達(dá)與HaloTag7融合的ADRM1 N端片段的細(xì)胞系作為模型系統(tǒng)，并將與底物靶向配體共軛的伯氯烷烴鏈作為同源UID化合物進(jìn)行測(cè)試（圖4B），合成了靶向溴和外端結(jié)構(gòu)域（BET）家族蛋白的原型UID。

       研究發(fā)現(xiàn)，由ADRM1結(jié)合物和JQ1組成的異二價(jià)分子（ByeTACs）在納摩爾濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)了不依賴泛素化的蛋白酶體降解BRD4，他們也指出這些發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但該研究表明目標(biāo)蛋白募集到蛋白酶體可能足以有效降解[1]。

       圖4.直接與26S蛋白酶體結(jié)合的降解物

       總之，這些可替代的TPD方法不僅補(bǔ)充了用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的第一代PROTAC，而且還提供了靶向位于細(xì)胞膜和細(xì)胞外空間的病理蛋白質(zhì)獨(dú)特策略。