小核酸藥物，是近年來(lái)新藥研發(fā)的重要類型之一。雖然，其分支ASO、siRNA正處于高產(chǎn)出階段，但仍存在一些技術(shù)問題無(wú)法解決。

       有研究者將目光聚焦到激活機(jī)制的saRNA，以期尋求技術(shù)與領(lǐng)域的突破，并已有產(chǎn)品進(jìn)入到臨床開發(fā)。

       小核酸藥物「再次出發(fā)」。

       01

       saRNA發(fā)現(xiàn)歷史&技術(shù)特點(diǎn)

       最早提出激活RNA的概念，可追溯到上世紀(jì)60年代，有研究者認(rèn)為存在一類只分布于細(xì)胞核的RNA，可與受體基因結(jié)合，形成序列特異性復(fù)合物并誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄對(duì)應(yīng)的RNA。但在當(dāng)時(shí)并未引起足夠的重視。

       2006年，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在p21、VEGF等多個(gè)基因的一定距離的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)短雙鏈RNA（dsRNA），可上調(diào)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，并將這種具有靶向激活靶基因的短核苷酸雙鏈命名為saRNA。

       saRNA，作為一類非編碼RNA，結(jié)構(gòu)類似于siRNA，但生物學(xué)功能完全相反。siRNA可以分別與AGO1、AGO2、AGO3和AGO4四種蛋白結(jié)合以獲得活性，而saRNA只能被特異性地加載到AGO2蛋白行使功能。

       目前接受程度較高的RNAa基因調(diào)控模型為：

       1）外源性saRNA被加載到細(xì)胞質(zhì)中的AGO2蛋白上；

       2）AGO2蛋白通過切割和丟棄其中一條RNA鏈，形成一個(gè)活性的AGO2-RNA復(fù)合物，并進(jìn)入細(xì)胞核；

       3）AGO2-RNA復(fù)合物將結(jié)合到基因組DNA序列或DNA相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列，進(jìn)一步形成RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物；

       4）該復(fù)合物與hnRNPs、RNAPⅡ和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。

       圖1 saRNA結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       02

       saRNA藥物設(shè)計(jì)

       相較于siRNA，saRNA技術(shù)的開發(fā)投入遠(yuǎn)不如siRNA廣泛及具商業(yè)化特點(diǎn)的積累，目前有研究者提出如下序列設(shè)計(jì)原則：

       1）目標(biāo)序列從靶基因的正義鏈序列上篩選；

       2）saRNA靶點(diǎn)選擇在正義鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1200～-200 bp的區(qū)域；

       3）每個(gè)靶點(diǎn)長(zhǎng)度的堿基數(shù)相對(duì)固定；

       4）靶點(diǎn)堿基的GC含量在40%～65%范圍內(nèi)；

       5）不能夠出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上相同的核苷酸；

       6）第19個(gè)堿基是A；第18個(gè)堿基是A或T，最好是A；第七個(gè)堿基最好是T；第20-23個(gè)堿基最好是A或T；

       7）選擇目標(biāo)序列時(shí)避開易受DNA甲基化影響的位點(diǎn)。

       類似于siRNA，saRNA同樣可能引發(fā)脫靶效應(yīng)，即以序列特異性或非序列特異性的方式誘發(fā)非預(yù)期的基因活性。為了避免序列特異性脫靶反應(yīng)，所設(shè)計(jì)的序列還應(yīng)該進(jìn)行序列BLAST以避免與人類基因組其他核苷酸序列有顯著同源性。另外，saRNA結(jié)構(gòu)的修飾被證明可以阻斷脫靶效應(yīng)，這部分的工作進(jìn)行的相對(duì)廣泛。

       圖2 特異性上調(diào)抑癌基因表達(dá)的saRNA序列

       圖片來(lái)源：DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2019.55.495

       03

       saRNA抗腫瘤特點(diǎn)及主要品種

       saRNA，通過作用于基因調(diào)控序列的特異位點(diǎn)，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，這已經(jīng)得到學(xué)者們的普遍認(rèn)同，并成為新的腫瘤研究熱點(diǎn)。這一點(diǎn)不同于早期的siRNA，以及ASO類藥物。

       目前，技術(shù)較成熟的小核酸領(lǐng)域藥物當(dāng)屬ASO和siRNA，但上述二者的獲批適應(yīng)癥主要集中于遺傳疾病、罕見病領(lǐng)域，眾多已上市品種中，無(wú)腫瘤適應(yīng)癥獲批。而saRNA開發(fā)的起點(diǎn)，即以腫瘤領(lǐng)域?yàn)橹?，這大不相同于“傳統(tǒng)”小核酸藥物，這也是其受關(guān)注的重點(diǎn)原因之一。如p21、p53等腫瘤領(lǐng)域著名靶基因及靶點(diǎn)，均為saRNA開發(fā)的方向內(nèi)容。

       圖3 激活寡核苷酸靶向腫瘤抑癌基因

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       但由于saRNA藥物開發(fā)仍處于早期階段，目前進(jìn)入臨床的品種并不多。最 具代表性的saRNA產(chǎn)品當(dāng)屬M(fèi)TL-CEBPA，臨床用于肝癌的治療，目前最高臨床階段為II期。

       據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CEBPA是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)肝臟穩(wěn)態(tài)，CEBPA表達(dá)下調(diào)與多種致癌過程有關(guān)。研究者將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26注射到對(duì)抗PD-1治療敏感的小鼠中用以構(gòu)建小鼠結(jié)直腸癌模型，然后注射MTL-CEBPA和PD-1抑制劑。MTL-CEBPA或PD-1抑制劑單獨(dú)處理的動(dòng)物腫瘤體積差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而同時(shí)注射PD-1抑制劑和MTL-CEBPA組的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，說明MTL-CEBPA和PD-1抑制劑具有協(xié)同作用，且同時(shí)注射PD-1抑制劑和MTL-CEBPA的腫瘤組織CEBPA mRNA表達(dá)量更高（8.69倍，P＜0.0001）。

       另，同樣可重點(diǎn)關(guān)注的品種還有我國(guó)國(guó)內(nèi)開發(fā)的RAG-01，處于臨床I期，是一款首 創(chuàng)作用機(jī)制的特異性靶向激活腫瘤抑制基因p21的雙鏈saRNA藥物，通過RNAa機(jī)制激活p21基因的表達(dá)，以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老。臨床前藥效研究表明，通過開發(fā)公司的小核酸遞送系統(tǒng)，RAG-01的治療能夠顯著抑制動(dòng)物模型中膀胱癌腫瘤的生長(zhǎng)，并展示充分的安全性。

       圖4 全球范圍開發(fā)的saRNA相關(guān)腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)展（文獻(xiàn)舉例）

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       04

       saRNA技術(shù)布局公司

       當(dāng)前，基于saRNA技術(shù)進(jìn)入臨床的產(chǎn)品極少，從而對(duì)應(yīng)的開發(fā)公司也相對(duì)不多。

       如上所述的MTL-CEBPA，原研單位為The University of Texas Southwestern Medical Center，其在藥物研發(fā)領(lǐng)域的布局較廣，技術(shù)類型涉及小分子化藥、aav產(chǎn)品、RNA產(chǎn)品等，疾病領(lǐng)域集中于腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)。另，MiNA Therapeutics公司的pipeline對(duì)MTL-CEBPA相關(guān)信息進(jìn)行了重點(diǎn)介紹，具體如該品種的AACR年會(huì)公開信息、臨床Ib期對(duì)實(shí)體瘤的聯(lián)合治療、單藥用于肝癌治療的I期臨床等。

       圖5 MiNA Therapeutics聚焦的疾病領(lǐng)域與開發(fā)項(xiàng)目

       圖片來(lái)源：https://minatx.com/pipeline/#section_three

       值得一提的是，RAG-01的開發(fā)公司中美瑞康，其技術(shù)重點(diǎn)布局于saRNA，在國(guó)內(nèi)以及國(guó)外均處于領(lǐng)先地位。

       其研發(fā)管線聚焦于目前尚無(wú)靶向治療藥物的疾病，包括單基因遺傳病（例如基因突變導(dǎo)致的單倍體劑量不足）。對(duì)于這些疾病，RNA激活通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄來(lái)補(bǔ)償或消除基因活性的損失。借助于全球領(lǐng)先的SCAD™，LiCO™，和GLORY™遞送平臺(tái)技術(shù)，中美瑞康布局了多樣化的管線項(xiàng)目，涵蓋中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉、眼科、肝臟和腫瘤等疾病治療領(lǐng)域。

       圖6 中美瑞康-pipeline

       圖片來(lái)源：https://cn.ractigen.com/pipeline/

       05

       結(jié)語(yǔ)

       新技術(shù)的開發(fā)與推進(jìn)，是新藥領(lǐng)域前進(jìn)的要素之一，saRNA無(wú)疑滿足這一點(diǎn)，尤其是從基因治療的角度來(lái)看。

       RNA激活技術(shù)在存在較大潛力的同時(shí)，同樣存在著諸多問題，如不成熟的激活序列篩選、穩(wěn)定性較差的人工合成saRNA、目標(biāo)基因的激活效果不佳、不同細(xì)胞調(diào)控方式的差異性、很難滿足腫瘤組織長(zhǎng)周期的抑制作用等等。

       但上述存在的技術(shù)問題很難阻止saRNA的開發(fā)與發(fā)展，且已有顯著的研究成果產(chǎn)生，并獲得資本方的認(rèn)可。未來(lái)幾年，該領(lǐng)域很大可能會(huì)快速產(chǎn)出部分產(chǎn)品，但更期待的無(wú)疑是最終的臨床數(shù)據(jù)。