嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T細(xì)胞治療在血液惡性腫瘤取得了巨大的成就。2017年，美國食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）首次批準(zhǔn)了兩種CAR-T療法，即tisagenlecleucel（Kymriah®）和Axicabatagene ciloleucel（Yescarta®），分別用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。到目前為止，已有5種CAR-T療法得到了批準(zhǔn)。CAR-T細(xì)胞療法作為癌癥治療方面革命性的生物技術(shù)產(chǎn)品，展現(xiàn)出未來征服癌癥的卓越潛力。

       然而CAR-T細(xì)胞仍存在一些不足，例如副作用、毒性、T細(xì)胞耗竭，并且在實(shí)體瘤的治療中顯示出很低的療效等。目前，以CAR技術(shù)為核心的新型細(xì)胞療法，CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬細(xì)胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等異軍突起，尤其CAR-NK和CAR-M在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

       1

       CAR-T細(xì)胞發(fā)展簡史

       回顧C(jī)AR-T的發(fā)展史，首先要提到1957年Thomas及其同事報(bào)告的首次白血病患者骨髓移植以及隨后Miller等人發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg報(bào)告了一項(xiàng)關(guān)于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的研究，這才讓人們將目光鎖定在“患者自身的免疫細(xì)胞可以對抗自身癌癥”的理念上。

       1992年，Sadelain等人成功地建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到T淋巴細(xì)胞的方法，使基因修飾成為在實(shí)驗(yàn)或治療環(huán)境中控制免疫的手段。幾乎與此同時(shí)，ZeligEshhar及其同事利用抗體結(jié)合域和T細(xì)胞受體上免疫球蛋白的γ或ζ亞單位，通過嵌合單鏈設(shè)計(jì)了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的特異性激活，從而開發(fā)出第一代CAR-T細(xì)胞。

       五年后，Sadelain博士的研究小組證明，將CD28等共刺激信號(hào)整合到CAR-T中可增強(qiáng)生存、增殖并保持活性，從而開發(fā)出第二代CAR。隨后，攜帶靶向CD19的CAR-T細(xì)胞被開發(fā)出來，并啟動(dòng)了慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）和急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的I期臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果證明CAR-T療法在化療難治性ALL的成人中誘導(dǎo)有效緩解，隨后生物工藝生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大。

       2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了CD19 CAR-T細(xì)胞療法（Tisagenlecleucel）適用于兒童和年輕人的ALL。到目前為止，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了五種用于癌癥治療的CAR-T細(xì)胞治療藥物。

       2

       CAR-T細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)

       CAR-T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)，主要與副作用、毒性、T細(xì)胞耗竭和惡性腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)。此外，在大規(guī)模生產(chǎn)中的制造過程目前既耗時(shí)又昂貴，因此，使盡可能多的患者接受CAR-T細(xì)胞免疫治療成為一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。

       1.副作用和毒性

       在CAR-T細(xì)胞輸注后，這種免疫療法可能具有潛在的致命毒性。毒性主要有兩類：細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性（NTX）或CAR-T細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征（CRES）。

       CRS或“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是一種全身炎癥反應(yīng)，由大量活化淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）以及髓系細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞）引起廣泛的臨床癥狀，包括發(fā)熱、疲勞、頭痛、皮疹、關(guān)節(jié)痛和肌痛。NTX是CAR-T細(xì)胞免疫治療的另一常見并發(fā)癥，發(fā)生在40%以上的患者中?；颊弑憩F(xiàn)出各種癥狀，如困惑、遲鈍、震顫、譫妄、找詞困難和頭痛。

       2.CAR-T細(xì)胞耗竭

       盡管CAR-T細(xì)胞治療完全緩解率高，然而大部分獲得緩解的患者在幾年內(nèi)表現(xiàn)出疾病復(fù)發(fā)，B-ALL的復(fù)發(fā)率從21%到45%不等，并隨著隨訪時(shí)間的延長而增加。治療失敗的部分原因是實(shí)體瘤產(chǎn)生的TME導(dǎo)致的CAR-T細(xì)胞耗竭。

       CAR-T細(xì)胞耗竭是指一種功能障礙狀態(tài)，其特征是由于持續(xù)的抗原刺激、CAR結(jié)構(gòu)的共刺激域和抑制性受體的表達(dá)增加而導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的缺失。體外CAR-T細(xì)胞研究表明，在CAR-T細(xì)胞耗竭過程中，抑制性受體（如PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表達(dá)上調(diào)，以及通過CTLA-4抑制PI3K/AKT通路，是導(dǎo)致抗腫瘤功能喪失的主要原因。細(xì)胞因子在其中也起著重要作用，如耗竭的CAR-T細(xì)胞降低表達(dá)分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力此外。其他因素，如轉(zhuǎn)錄因子、代謝和表觀遺傳修飾，也在CAR-T細(xì)胞耗竭發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

       3.腫瘤微環(huán)境

       CAR T細(xì)胞免疫治療在實(shí)體瘤中尚未取得成功。一個(gè)可能的原因是TME的免疫抑制性質(zhì)影響過繼免疫治療的療效。實(shí)體瘤存在高度浸潤間質(zhì)細(xì)胞，如癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和抑制性免疫細(xì)胞，包括髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（TAN）、肥大細(xì)胞，和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），它們有助于建立一種免疫抑制性TME，能夠干擾CAR-T細(xì)胞療法的療效。

       3

       CAR-NK的研究概況

       NK細(xì)胞是第一個(gè)被鑒定的先天性淋巴細(xì)胞（ILC）亞型，能對病毒感染和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生多種效應(yīng)器功能，主要是細(xì)胞殺傷和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。CAR-NK療法的研究目前處于起步階段，臨床前和臨床研究的數(shù)量逐年增加，這體現(xiàn)在每年都在增加的關(guān)于CAR-NK的研究論文。

       此外，在研究的靶標(biāo)方面，Her2是實(shí)體瘤最常用的靶點(diǎn)，而CD19抗原在血液腫瘤中最常見。使用原代NK細(xì)胞的研究中，65%的人在研究B細(xì)胞惡性腫瘤，CD19是最受 歡迎的靶點(diǎn)。有趣的是，在使用NK細(xì)胞系的研究中，研究實(shí)體瘤是血液惡性腫瘤的2倍以上。

       在臨床研究方面， CD19-CAR-NK細(xì)胞對血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細(xì)胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR-NK細(xì)胞臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

       還有多項(xiàng)針對實(shí)體瘤的研究處于啟動(dòng)或招募階段。

       4

       CAR-NK的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

       CAR-NK細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞一樣存在胞外、跨膜和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。NK細(xì)胞通過另外兩個(gè)共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細(xì)胞毒性能力和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤特異性靶向性和細(xì)胞毒性。CAR-NK細(xì)胞療法可能在未來成為CAR-T療法的替代方案，因?yàn)镃AR-NK細(xì)胞具有以下超越CAR-T的幾個(gè)獨(dú)特特征。

       首先，異基因NK細(xì)胞對于過繼性細(xì)胞治療（ACT）是相當(dāng)安全的，因?yàn)樗鼈兺ǔ２唤閷?dǎo)發(fā)生GVHD。此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產(chǎn)生啟動(dòng)CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過單鏈抗體識(shí)別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識(shí)別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生。

       與此同時(shí)，CAR-NK也面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，輸注細(xì)胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細(xì)胞治療的主要缺點(diǎn)之一。雖然它可能更安全的，但它也會(huì)限制NK細(xì)胞免疫治療的效果。其次，快速歸巢到腫瘤床對于過繼性細(xì)胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子之間復(fù)雜相互作用的控制。然而，NK細(xì)胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。第三，同CAR-T類似，TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細(xì)胞和妨礙免疫細(xì)胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細(xì)胞治療的主要障礙。最后，基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細(xì)胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為一個(gè)挑戰(zhàn)。

       5

       CAR-M的研究進(jìn)展

       鑒于CAR-T細(xì)胞治療的成功和CAR-NK細(xì)胞的發(fā)展?jié)摿Γ芯咳藛T對開發(fā)用于腫瘤免疫治療的CAR巨噬細(xì)胞（CAR-M）產(chǎn)生了極大的興趣。CAR-M的出現(xiàn)為治療實(shí)體瘤開辟了新的可能性：用特異性CARs修飾人巨噬細(xì)胞，以提高巨噬細(xì)胞對腫瘤的吞噬活性和抗原呈遞。

       目前使用CAR-M治療癌癥已進(jìn)行了多種嘗試。研究人員設(shè)計(jì)了嵌合抗原受體吞噬細(xì)胞（CAR-P），它可以引導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬特定的靶細(xì)胞。

       研究證明，表達(dá)Megf10或FcRv胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR-P可促進(jìn)對靶抗原的吞噬能力。CAR-PMegf10可以特異性地觸發(fā)對靶向配體的吞噬作用，通過酪氨酸磷酸化的局部信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)吞噬，TCR-CD3ζ可能通過招募syk激酶而促進(jìn)CAR-P的吞噬作用。

       全細(xì)胞吞噬是比較罕見的，而啃咬靶細(xì)胞更為頻繁，這表明CAR-P巨噬細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的相互作用不足以觸發(fā)直接的全細(xì)胞吞噬。已有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號(hào)在大靶點(diǎn)的內(nèi)吞過程中起重要作用，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。研究人員將pI3K p85亞單位與CAR-P-FcRv連接起來，形成一個(gè)“串聯(lián)”CAR（CAR-Ptandem）。CAR-Ptandem具有較好的全細(xì)胞吞噬功能。

       賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員使用含有CD3-ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的抗HER2的CAR-M。在兩種實(shí)體瘤移植的異位小鼠模型中，單次注射抗HER2-CAR-M可降低腫瘤負(fù)荷，延長小鼠存活時(shí)間。在人源化小鼠模型中還發(fā)現(xiàn)， HER2-CAR-M能夠?qū)2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥性腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性。此外，還發(fā)現(xiàn)HER2-CAR-M可能產(chǎn)生表位擴(kuò)散，為避免腫瘤免疫逃逸提供了新思路。

       Zhang等人利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）表達(dá)CAR結(jié)構(gòu)并分化為巨噬細(xì)胞，命名為CAR-iMac。研究表明，表達(dá)CAR的iPSCs能分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，在無抗原的情況下，CAR-iMac更接近M2極化狀態(tài)。然而，在存在特異性抗原的情況下如CD19，CAR介導(dǎo)的信號(hào)促進(jìn)了CAR-iMac的吞噬作用，并導(dǎo)致CAR-iMac向促炎的M1型的轉(zhuǎn)化。iPSC來源的巨噬細(xì)胞可能成為髓系腫瘤免疫治療的重要細(xì)胞來源。

       CAR-T治療實(shí)體瘤無效的一個(gè)重要原因是T細(xì)胞難以進(jìn)入腫瘤組織。這是因?yàn)閷?shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成的物理屏障阻止了T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織。ECM由高度有序的纖維分子、糖蛋白和其他大分子產(chǎn)生，其合成和降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的調(diào)控，而巨噬細(xì)胞就是MMP的重要來源。

       研究人員設(shè)計(jì)了一種CAR-147的結(jié)構(gòu)，它由靶向人HER2的單鏈抗體、IghG1的鉸鏈區(qū)和小鼠CD147分子的跨膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組成。CAR-147與HER2+人乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，在CAR-147巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)多個(gè)MMP的表達(dá)，證明CAR-147能特異性識(shí)別HER2抗原，有效激活巨噬細(xì)胞中MMP的表達(dá)。CAR-147巨噬細(xì)胞在體外不抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但靜脈注射CAR-147巨噬細(xì)胞可顯著抑制4T1乳腺癌小鼠模型的腫瘤生長。同時(shí)發(fā)現(xiàn)用CAR-147巨噬細(xì)胞治療的腫瘤中T細(xì)胞所占的比例遠(yuǎn)高于對照巨噬細(xì)胞治療的腫瘤，說明CAR-147巨噬細(xì)胞能破壞腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)T細(xì)胞向腫瘤浸潤。

       6

       CAR-M治療實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用

       直到2020年11月，兩個(gè)基于CAR-M策略的臨床試驗(yàn)已經(jīng)獲得FDA的批準(zhǔn)。第一個(gè)是來自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT-0508，它用抗HER2的CAR-M治療復(fù)發(fā)/難治性HER2過度表達(dá)的腫瘤患者（I期臨床試驗(yàn)）。另一個(gè)是Maxyte的MCY-M11，它利用mRNA轉(zhuǎn)染PBMC表達(dá)靶向間皮素的CAR（包括CAR-M），治療復(fù)發(fā)/難治性卵巢癌和腹膜間皮瘤患者，目前正在招募志愿者進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。

       關(guān)于CAR-M的臨床轉(zhuǎn)化，有幾個(gè)方面需要注意：第一，CAR-M的安全性和有效性是該療法的基礎(chǔ)，雖然已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，但CAR-M在人體內(nèi)的安全性和有效性仍有待驗(yàn)證；其次，可靠的細(xì)胞來源和擴(kuò)增是CAR-M臨床應(yīng)用的必要條件，CAR-M可由PBMC或iPSCs制備。此外，與T細(xì)胞不同，巨噬細(xì)胞發(fā)生GVHD的風(fēng)險(xiǎn)較低，這意味著可以提前生產(chǎn)產(chǎn)品，供患者按需使用。第三，還有一個(gè)問題必須考慮，目前，CAR-M多采用病毒轉(zhuǎn)染的方法，可能會(huì)誘發(fā)插入突變， CRISPR/Cas9為解決這一問題提供了新的可能性，僅需一周即可完成CAR-T基因的編輯。

       7

       CAR-M的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

       與CAR-T和CAR-NK細(xì)胞相似，CAR-M細(xì)胞由識(shí)別特定腫瘤抗原的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)域、跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)區(qū)域組成。目前，對細(xì)胞外信號(hào)域的研究主要幾種在幾種常見的腫瘤靶點(diǎn)，如CD19和HER2。

       與CAR-T細(xì)胞不同，CAR-M細(xì)胞具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

       1）由于腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)形成的物理屏障，T細(xì)胞不能進(jìn)入腫瘤環(huán)境，而巨噬細(xì)胞可以明顯地浸入腫瘤環(huán)境中。TAM在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫抑制和血管生成中起著重要作用。CAR-M能降低TAM的比例，影響TAM的細(xì)胞表型，對腫瘤的治療有積極作用。

       2）CAR-M除了具有吞噬腫瘤細(xì)胞的作用外，還具有促進(jìn)抗原提呈能力和增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷的作用。

       3）與CAR-T相比，CAR-M的循環(huán)時(shí)間有限，非腫瘤靶向毒性較小。

       盡管CAR-M有很大的潛力成為一種強(qiáng)有力的腫瘤免疫治療方法，但要達(dá)到預(yù)期的效果還需要克服許多問題。首先是細(xì)胞數(shù)量的限制：無論是在體外還是在體內(nèi)注射后，巨噬細(xì)胞都不會(huì)增殖?；颊咧荒芙邮苡邢迶?shù)量的巨噬細(xì)胞，這可能會(huì)影響治療效果。二是與巨噬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移特性有關(guān)。注射后，外源性巨噬細(xì)胞通過肺部，然后大部分留在肝臟，不利于癌癥的治療。三是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。盡管CAR-M在小鼠模型中取得了很好的效果，但人類實(shí)際的腫瘤微環(huán)境要比動(dòng)物模型復(fù)雜得多。最后，由于腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性，靶抗原的表達(dá)可能不夠。這一問題在CAR-T治療中一直非常突出。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)被CAR-T細(xì)胞去除的腫瘤細(xì)胞都有高水平的靶抗原表達(dá)?？梢灶A(yù)見，這也將成為CAR-M療法發(fā)展的一大障礙。

       — 小結(jié) —

       NK細(xì)胞是一類獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受 MHC 限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能。CAR-NK細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。CAR-M療法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已顯示出其有效的抗腫瘤能力。與CAR-T和CAR-NK相比，CAR-M作為一種新的細(xì)胞免疫療法有其獨(dú)特的優(yōu)勢，但也有許多不足需要克服。因此，在今后的臨床治療中應(yīng)注意最大限度地提高CAR-M的有效性和安全性。我們有理由相信，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，CAR-NK和CAR-M很快將在患者身上顯示出療效，為腫瘤免疫治療再添助力！