小腦（cerebellum, CB）對于運(yùn)動行為的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，還與語言、空間處理、工作記憶、執(zhí)行功能和情緒處理等人類認(rèn)知功能息息相關(guān)，因此在腦科學(xué)領(lǐng)域收到了廣泛的關(guān)注。
在所有的哺乳動物中，小腦起源于菱腦原節(jié)1號區(qū)域（rhombomere 1, r1），r1區(qū)域又包含了腦室區(qū)（ventricular zone, VZ）和菱唇（rhomboid lip, RL）。腦室區(qū)可生成γ-氨基丁酸能神經(jīng)元（GABAergic neuron，一類釋放γ-氨基丁酸的神經(jīng)元），如浦肯野細(xì)胞（Purkinje cell）；而菱唇負(fù)責(zé)生成谷氨酸能神經(jīng)元（Glutamatergic neurons，一類釋放谷氨酸的神經(jīng)元），如顆粒細(xì)胞（granule cell）。
盡管小腦發(fā)育的早期階段在不同物種之間具有保守性，但與其他哺乳動物相比，人類小腦具有神經(jīng)元亞型比例改變和小葉復(fù)雜性增加這兩大主要特征，并且菱唇中存在一些人類特有的神經(jīng)祖細(xì)胞。菱唇的發(fā)育異常與多種小腦疾病相關(guān)，比如Dandy-Walker畸形、小腦蚓部發(fā)育不良和髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma）等。而其他小腦疾病，像自閉癥和共濟(jì)失調(diào)(Ataxia)，與浦肯野細(xì)胞的退化有關(guān)。
上述這些疾病主要在小鼠模型中進(jìn)行研究，但小鼠模型無法完全體現(xiàn)人類小腦細(xì)胞多樣性以及功能特征，也無法完全重現(xiàn)人類疾病的各種表型。比如，在共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥患者中觀察到浦肯野細(xì)胞缺失，這一表型無法在小鼠模型中體現(xiàn)。因此，腦科學(xué)家們迫切需要開發(fā)一種可以產(chǎn)生功能性浦肯野細(xì)胞的人源小腦細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)。
美國加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院Giorgia Quadrato團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種人類小腦類器官（hCerO），可以讓包含浦肯野細(xì)胞在內(nèi)的功能性小腦細(xì)胞，在體外人源三維環(huán)境中長期健康存活和成熟。相關(guān)成果以“Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells”為題，2024年1月4日發(fā)表在Cell Stem Cell雜志上。
研究團(tuán)隊(duì)基于誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPSC）產(chǎn)生hCero類器官。本文展示的培養(yǎng)方案，可以在類器官中形成人類小腦發(fā)育期間的主要細(xì)胞類型，包含胎兒菱唇中的特定祖細(xì)胞亞群以及浦肯野細(xì)胞。該培養(yǎng)方案具有很好的重復(fù)性，可以用于研究小腦發(fā)育與疾病中的細(xì)胞類型相關(guān)的特定分子機(jī)制。此外，hCerO類器官還顯示有組織的層狀結(jié)構(gòu)，很像小腦發(fā)育階段的顆粒層（granule layer, EGL）和浦肯野細(xì)胞層（Purkinje cell layer， PCL）。
hCerO培養(yǎng)示意圖
DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013
培養(yǎng)僅2個月的hCero類器官，可以形成神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)。長期培養(yǎng)可以增加hCerO中興奮性和抑制性神經(jīng)元之間的功能連接水平。這些研究數(shù)據(jù)，為使用hCerO模擬與小腦微循環(huán)發(fā)育功能障礙相關(guān)的功能損傷奠定了良好的基礎(chǔ)。
hCerO的鈣信號成像
DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013
通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段，基于PCP2、DAB1、RORA和FOXP2等經(jīng)典標(biāo)志物，研究人員在培養(yǎng)6個月的hCerO類器官的外周發(fā)現(xiàn)了浦肯野細(xì)胞。此外，利用鈣成像、膜片鉗和鈣結(jié)合蛋白染色等手段，發(fā)現(xiàn)hCerO類器官中的浦肯野細(xì)胞具有顯著的樹狀末梢和不同的細(xì)胞形態(tài)。這是首次在體外全人源細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，成功培養(yǎng)出具有功能性的浦肯野細(xì)胞。
hCerO的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013
展望與不足
本文通訊作者Giorgia Quadrato
（https://quadratolab.usc.edu/people/）
本文解決了腦科學(xué)領(lǐng)域的一個重大技術(shù)難題，hCerO小腦類器官有望用于研究人類小腦發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和疾病過程中的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。本文為進(jìn)一步認(rèn)識小腦進(jìn)化生物學(xué)，研究與菱唇發(fā)育相關(guān)疾病，重現(xiàn)小腦與其他腦區(qū)的連接，加速腦病相關(guān)藥物研發(fā)，提供了一種有效的研究工具。
但本文有以下三個的不足：
（1）用于深入分析的細(xì)胞系數(shù)量較少
在構(gòu)建hCerO類器官時，使用了多種人多功能干細(xì)胞（hPSC）的細(xì)胞系，但在分析類器官的細(xì)胞多樣性和區(qū)域特征時，只選擇了其中一種細(xì)胞系。研究團(tuán)隊(duì)無法明確，不同的細(xì)胞系是否會產(chǎn)生不同的類器官細(xì)胞組成，或者不同的細(xì)胞系是否會導(dǎo)致不同的結(jié)論。所以，未來有必要納入更多的人多功能干細(xì)胞系用于分析，以此來提供培養(yǎng)方案的有效性。
（2）類器官培養(yǎng)時長不夠
研究人員只在培養(yǎng)了6個月的hCerO中對浦肯野細(xì)胞進(jìn)行了功能分析，有必要在更長的發(fā)育周期內(nèi)，研究浦肯野細(xì)胞的功能和形態(tài)發(fā)育。
（3）缺少細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
未來需要增加活體成像實(shí)驗(yàn)，來觀察hCerO中的細(xì)胞遷移行為。這可以更好地研究顆粒細(xì)胞在類器官邊緣的切向（tangential）移動或者層狀結(jié)構(gòu)（laminar layering）的短暫形成。
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