長期以來，多肽藥物開發(fā)最重要的目標被定為最高親和力、受體選擇性和抗酶降解穩(wěn)定性。然而在滿足生物活性的基礎上，多肽藥物的遞送方式逐漸成為了行業(yè)的研究熱點，尤其是口服活性肽已經成為了追求的新目標。生產口服活性肽需要雙重優(yōu)化過程：1) 優(yōu)化親和力和選擇性；2) 優(yōu)化口服有效性。為了合理設計口服活性肽，必須依次滿足這兩個條件。

       多肽的化學改性對于實現口服制劑的開發(fā)影響重大，這篇文章重點介紹了已經上市或處在臨床階段的口服多肽制劑，希望透過這些成功的經驗，指導人們應該從什么角度進行多肽的化學修飾，以同時滿足多肽潛在藥物的生物活性和口服生物利用度。

       Cyclosporine A (CsA, 環(huán)孢素A)

       真菌代謝物環(huán)孢素A (CsA) 由Sandoz在上世紀60年代末發(fā)現。CsA是一個包含7個N-甲基化氨基酸殘基的十一元環(huán)肽。CsA由占絕 對優(yōu)勢的疏水性氨基酸組成，它作為一種口服免疫抑制劑，以Neoral?的商品名稱得到批準上市。除了用于移植時免疫抑制外，Neoral?還可用于治療牛皮癬、嚴重異位性皮膚炎（severe atopic dermatitis）、壞疽性膿皮病（pyoderma gangrenosum）、慢性自體免疫蕁麻疹（chronic autoimmune urticaria）、類風濕性關節(jié)炎和其他的相關疾病，但通常只用于比較嚴重的疾病。在美國常做成眼用乳劑治療干眼癥。

       由于其高度的疏水性，CsA在純溶液配方中口服生物利用度差，非常不穩(wěn)定，這是由于其水溶性差，以及腸上皮細胞的代謝導致的。CsA實現口服遞送的機制非常特別，除了環(huán)肽結構本身帶來的天然優(yōu)勢之外，Me-Leu9和Me-Leu10兩個相鄰殘基之間的酰胺鍵的構象在其中發(fā)揮了微妙但關鍵的作用（圖1）[1]。這個結構特殊的肽骨架酰胺鍵的cis/trans構象平衡，在很大程度上取決于多肽分子所處環(huán)境的極性。在極性溶劑中，或者與受體親環(huán)蛋白（cyclophilin）結合的情況下，trans構象占主導地位。但在非極性溶劑，或者晶體形態(tài)下，采取主導的則換成了cis構象。

       圖1. CsA化學結構（紅色酰胺鍵為Me-Leu9-Me-Leu10主鏈肽鍵）

       Kofron等人在他們的研究中發(fā)現，cis/trans相互轉化動力學（能量壁壘為19 kcal/mol）與CsA和親環(huán)蛋白的結合息息相關[2]。而CsA-親環(huán)蛋白復合物的形成，反過來又對鈣調神經磷酸酶產生影響。后者是一種Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白磷酸酶，它是T淋巴細胞中的關鍵信號酶。由于CsA中這個酰胺鍵的cis/trans平衡取決于環(huán)境的親水性，研究者因此提出假說，CsA會介導由cis到trans構象的轉化，前者利于口服吸收，而后者利于與受體的結合。而這恰好滿足了上述口服多肽藥物的兩個關鍵條件。

       CsA在其當前的口服制劑中（Sandimmune Neoral?）以脂質基礎配方（這是由于CsA“過高”的親脂性決定的），具有獨特的微乳液給藥方式，可實現60%生物利用度并具有相對較低的可變性[3]。CsA這種天然產物機制的復雜性是獨一無二的，已成為研究多肽口服制劑生物利用度的主要模型。然而，微妙的構象轉化很難復制在其它的合成多肽類似物中，從這個角度上看，CsA仍然像個曲高和寡的孤例，盡管令人高山仰止，但卻很難復制它的高生物利用度機制。

       值得注意的是，2022年10月得到FDA批準上市的Voclosporin (商品名Lupkynis)是CsA的類似物，也是一款口服多肽，是用作治療狼瘡性腎炎的免疫抑制劑。擁有長達30小時的終末半衰期，人的口服生物利用度約為8%[4]。

       Voclosporin的化學結構實在與它的前輩cyclosporin太相似了，它只是用一個乙烯基替換了CsA 1位氨基酸殘基側鏈的甲基（圖2中紅色結構），而其它結構則完全相同。

       圖2. Voclosporin化學結構

       三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽

       圖3. 三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽化學結構

       Veber-Hirschmann肽c(PFwKTF)，是一種環(huán)化的生長抑素，對sst2和sst5生長抑素受體有選擇性，其三N-甲基化類似物，三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽（圖3）表現出了更高的生物利用度，可有效穿過Caco-2細胞單層。三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽對血漿中的降解具有一定抵抗性，并且實現了10%的大鼠絕 對口服生物利用度[5]。顯然，這三處溶劑化的酰胺鍵的N-甲基化增加了多肽的親脂性。該多肽主鏈形成了兩處βII’和βVI-轉角二級結構，以及一個以cis-構象為主導的肽鍵。而這三處修飾依然保持了未甲基化的，具有生物活性Veber-Hirschmann肽的空間構型[6]。

       去氨加壓素

       Ferring Pharmaceuticals的去氨加壓素Desmopressin是激素肽加壓素vasopressin的肽類似物（圖4），它比加壓素更能抵抗酶降解。其產品DDAVP?以口服劑的形式得到批準上市，用于尿崩癥（diabetes insipindus）的治療。Nocdurna?（仍然是desmopressin）又以舌下片劑的劑型獲得批準，用于夜尿癥的治療。不良反應鮮有報道，甚至已經對兒童進行了夜間遺尿治療。

       圖4. Desmopressin化學結構

       從化學結構來看，去氨加壓素是一種由二硫鍵連接的親水性環(huán)狀肽，具有廣泛的氫鍵潛力。口服的去氨加壓素通過細胞旁轉運機制被吸收到血流中，口服生物利用度差（0.08-1%）[7]。盡管如此，去氨加壓素較高的靶標親和力實現了低劑量的給藥[8]。由于去氨加壓素的強大藥效和較高的親水性，去氨加壓素和a-鵝膏菌素給人們這樣的啟發(fā)：如果多肽藥物的活性和選擇性足夠高，在穩(wěn)定性的保障下，即便很低的口服生物利用度，也有可能成為口服制劑的選擇。

       ZYOG1

       圖5. ZYOG1化學結構

       ZYOG1（圖5）是一種可口服的線性肽，含有多個非天然氨基酸和三個Cα-甲基化氨基酸。ZYOG1類似于其他GLP-1激動劑，例如艾塞那肽，是一種源自exendin-4的化合物，并被開發(fā)用于治療糖尿病。N端Val被嵌合到這些線性多肽前體中，以改善它們的生物利用度。盡管ZYOG1的口服生物利用度相對較低，但據稱ZYOG1具有與皮下注射的艾塞那肽相當的良好口服功效（尚未公布絕 對值）。ZYOG1目前處于臨床試驗階段，需要進一步開發(fā)以提高其生物利用度，并最終證明這種線性肽是否可以作為口服GLP-1激動劑用于治療糖尿病。

       Griselimycin衍生物

       圖6. Griselimycin衍生物化學結構

       鏈霉菌衍生的griselimycin衍生物，通過抑制DNA聚合酶對結核分枝桿菌產生高度活性，由此可以充當抗菌劑的角色。通過摻入非天然親脂性氨基酸殘基，進一步提高了其depsipeptide母肽(F = 48%) 實現非常高的口服生物利用度。環(huán)己基取代Pro的griselimycin衍生物（R=Cychexyl, 圖6），顯示出了F=89%的高口服生物利用度，以及提高的生物活性。與其他口服活性肽相比，三種griselimycin衍生物（圖6）都具有極高的生物利用度。整體親脂性的增加，導致了更高的結合親和力和更高的生物利用度（griselimycin衍生物是由全疏水性氨基酸組成的環(huán)肽）。

       Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla)和Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla)

       圖7. Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （左）和 Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （右）化學結構

       常見的口服多肽似乎比較鐘情于六元環(huán)肽[9]，這種特征激發(fā)了人們把六元直線肽環(huán)化的熱情。最簡單直接的是全Ala環(huán)六肽，盡管這樣的多肽毫無生物活性，但它卻為六元環(huán)肽的空間結構研究提供了骨架，可以進行比如N-甲基化的化學修飾，以探索這些化學修飾可能對多肽空間結構帶來的影響，以進一步探求這些結構變化帶給多肽分子生物學的新特征。

       在多肽生物活性領域享有盛譽的RGD三肽結構（被多種integrin受體識別）在這種大背景下，被整合到各種六元環(huán)肽中，以實現包括消化道通透性提升在內的一系列目標。但親水性氨基酸的存在削弱了多肽分子的腸道通透性，因此研究人員采用了所謂的LPCM（lipophilic prodrug charge masking，親脂性前藥電荷掩蔽）策略，以對應高極性給這些RGD環(huán)肽帶來的不利影響[10]。LPC使得原本低細胞旁吸收的親水性母肽（clog P= -3.3），搖身變成了通過跨細胞途徑進入血液循環(huán)的多肽前藥（clog p=6.6），因此實現了Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) 肽（圖7）44%的口服生物利用度[11]。Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （圖7）在經過口服給藥后，被血清酯酶切割成其生物活性形式，成為了integrin αvβ3高活性和高選擇性的配體。這個生物活性配體可以增強 VEGF介導的血管新生，因此可以結合化學療法治療癌癥[12]。

       MyR-c(MyD 4-4)

       圖8. MyR-c(MyD 4-4)化學結構

       環(huán)肽c(MyD 4-4) （圖8）對于細胞質銜接蛋白MyD88的抑制作用，被開發(fā)于自身免疫性疾病的治療[13]。據報道c(MyD 4-4)多肽會破壞MyD88的二聚化和阻斷人和小鼠巨噬細胞TLR2和TLR4的刺激。為了克服c(MyD 4-4)低口服生物利用度的缺陷(F=0.84±0.25%)，研究人員在一個仲胺結構上偶合了肉豆蔻酰基（MyR），衍生出了MyR-c(MyD 4-4)多肽[14]。改性后的多肽擁有大幅度提高的口服生物利用度（F = 47.6±16.2%），同時增強了抑制劑的生物活性。研究人員將親水性的多肽c(MyD 4-4)在改性后口服生物利用度的大幅提高，歸功于親脂性的豆蔻?；鶊F的引入改變了多肽的空間結構，從而破壞了帶正電的精氨酸與帶負電的天門冬氨酸之間的鹽橋。MyR-c(MyD 4-4)的口服活性，得到了EAE的體內療效支持，這是一個多發(fā)性硬化癥的小鼠模型[14]。

       Endomorphin-1（內啡肽-1）類似物

       圖9. 內啡肽-1類似物化學結構

       線性阿 片肽內啡肽-1由四個天然氨基酸組成，顯然容易產生快速酶促降解，生物利用度差，持續(xù)時間短?？诜o藥途徑在這些數據面前，看起來有些天方夜譚。然而糖基化令內啡肽-1的生物利用度大大提高，為口服遞送打開了一扇大門[15]。

       經過乳糖和琥珀酸手臂修飾的內啡肽-1類似物（圖9），收獲了膜通透性700倍的增長和長達2小時的作用時間。但葡萄糖琥珀酸單元顯著降低了配體多肽結合μ-阿 片受體 (MOR) 的親和力，盡管在MOR的結合親和力和激動劑活性等表現上，endomorphin-1類似物受到修飾后呈現出不利影響，但它仍然顯示出納摩爾級的結合親和力，相對于生物利用度上的優(yōu)勢，生物活性方面的表現已經足夠令人滿意。它在經過大鼠口服后產生劑量依賴性的疼痛緩解。這個例子表明，在某些情況下糖基化有助于提高多肽的生物利用度，同時保留可以接受的受體結合親和力。糖基的選擇與糖基化的修飾位點，對于多肽口服制劑的開發(fā)影響明顯。

       司美格魯肽

       圖10. Semaglutide化學結構

       脂化修飾為多肽口服制劑打開了一扇廣闊的大門。諾和諾德的2型糖尿病口服多肽制劑Semaglutide（Rybelsus?）的成功 (2019年被FDA批準上市) ，極大激發(fā)了從業(yè)者開發(fā)口服多肽制劑的熱情，而它的成功經驗之一正是對GLP-1類似物進行脂肪修飾（圖10）。

       Semaglutide在口服給藥后，能夠保持很長的半衰期（約153-160小時，而注射后為 168小時）。但口服遞送的方式顯著降低了它的生物利用度，因此需要更高的每日劑量。未來用于多肽口服藥的脂化試劑，可能會尋求比semegluitde (18碳) 更短的脂肪酸（例如12碳），這可能會增加生物利用度。