細胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細胞死亡（細胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。

       IAP是細胞凋亡和促存活信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，其失調(diào)通常與腫瘤發(fā)生和生長息息相關(guān)。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類。目前，全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標，也可以作為E3連接酶設(shè)計特異性和非遺傳IAP依賴性蛋白消除劑SNIPERs降解靶標蛋白，還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑。

       01

       IAP結(jié)構(gòu)與功能

       細胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細胞周期過程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細胞凋亡。但是，癌細胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡，最終導致腫瘤的生長、預后不良和耐藥性等問題。

       IAP通過多種機制，在調(diào)節(jié)細胞死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

       哺乳動物IAP家族中有八個成員：細胞IAP1（c-IAP1）、X染色體連接IAP（XIAP）、細胞IAP2（c-IAP2）、神經(jīng)元IAP（NAIP）、泛素結(jié)合BIR結(jié)構(gòu)域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP樣蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。

       IAP由三個BIR結(jié)構(gòu)域（BIR1至BIR3）、一個泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域和一個C末端RING結(jié)構(gòu)域組成。cIAP1/2還包含一個CARD域（圖1）[2,3]。

       圖1. IAP蛋白的結(jié)構(gòu)域組織

       XIAP是唯一直接與半胱天冬酶3/7結(jié)合并抑制其活性的IAP（圖2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同細胞途徑的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接結(jié)合第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（Smac/Diablo），激發(fā)了大量化合物的設(shè)計和合成，稱為Smac模擬物（SMs）。

       XIAP抑制劑（半胱天冬酶-9，綠色表面）和效應半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋紅色表面），與 II 類BIR（分別為BIR3和BIR2）相互作用。

       特別是，II型BIR顯示為一個保守的IBM凹槽（藍色縮放視圖中的區(qū)域），其中包含在球體中報告的N端IAP結(jié)合基序（IBM）。Smac/Diablo在壓力刺激下從線粒體釋放，取代通過暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球體）的半胱天冬酶，這是SM的設(shè)計基礎(chǔ)。圖2B顯示cIAPs作為無活性單體存在于細胞質(zhì)中[3]。

       圖2. Smac/Diablo和SM涉及不同細胞途徑的靶向同源IAPs

       治療誘導cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以導致其降解。除了對半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs還參與腫瘤壞死因子-α（TNFα）誘導的細胞死亡信號傳導。

       02

       IAP拮抗劑

       最初研究者開發(fā)了一種IAP拮抗劑，靈感來自于AVPI肽，稱為第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的N末端序列。SMAC干擾XIAP與半胱天冬酶-9相互作用，抑制細胞凋亡。SMAC與cIAP1/2相互作用，并誘導構(gòu)象變化，導致自我泛素化和自我分解。

       這些結(jié)果表明，cIAP1/XIAP的雙重拮抗劑可通過外源性和內(nèi)源性途徑，促進細胞凋亡。早期擬肽IAP拮抗劑已從單價形式演變?yōu)槎r形式，以最大限度地提高其功效（圖3）[4]。

       近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一個非肽型IAP拮抗劑，稱為tolinapant，目前作為晚期實體瘤和淋巴瘤的靶標進行臨床試驗（圖3，NCT02503423），加強了IAP作為抗癌治療靶點的重要性[5]。

       圖3. 近期開發(fā)的第二種線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗劑的模擬抑制劑

       03

       E3連接酶

       E3連接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每個家族下又有其他分型。目前已知的E3連接酶約有600多種，但在PROTAC中常用配體的相關(guān)E3連接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四種（圖4），此外還有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等僅有少數(shù)配體報導的E3連接酶。

       圖4. 常見的E3連接酶配體

       除此之外，也已開發(fā)出了很多新型結(jié)構(gòu)E3連接酶配體，如圖5所示新型CRBN配體[6]。

       圖5. 新型CRBN配體

       近些年來，人們也在開發(fā)不同的E3連接酶用于PROTAC設(shè)計。如2021年，Ishida等人專注于發(fā)現(xiàn)用于PROTAC的新型E3泛素連接酶的新方法。這些方法包括分子建模方法，例如基于晶體學數(shù)據(jù)收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白質(zhì)分析（ABPP）篩查或表型篩查。通過這些方法，他們發(fā)現(xiàn)一些可以用于PROTACs設(shè)計的E3連接酶（圖6）[6]。

       圖6. 尚未探索用于PROTAC應用的E3泛素連接酶列表

       04

       基于IAP設(shè)計的SNIPERs

       基于IAP抑制劑可以設(shè)計SNIPERs，SNIPERs與PROTAC相似，可以招募E3連接酶來降解靶標蛋白，只是用的E3連接酶配體是IAP抑制劑。

       烏苯美司（BS）及其衍生物，顯示出與IAP的BIR3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性，因此誘導自我泛素化的蛋白酶體降解，或者使其它蛋白泛素化從而被降解。

       由于IAP具有如此高的親和力，人們可以基于BS結(jié)構(gòu)衍生得到SNIPERs（如圖7A所示）。Natio等人報道，甲基烏苯美司（MeBS）可以增強癌細胞對癌癥藥物誘導的細胞凋亡的化學敏感性，從而促進細胞凋亡[7]。

       機理研究揭示，MeBS誘導RING依賴性自身泛素化和通過與cIAP1的第三個BIR域結(jié)合，誘導cIAP1蛋白酶體降解（如圖7B所示）。SAR研究表明，即使用更龐大的基團取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基團沒有與cIAP1形成相互作用。這些結(jié)果促使Natio等人擴展分子框架以設(shè)計SNIPER，從甲基的位置連接接頭，該接頭進一步連接到對靶蛋白具有內(nèi)在活性的分子上，如圖7C所示。

       圖7.（A）烏苯美司及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)；（B）報道的cIAP降解機制；（C） SNIPERs作用機制

       除了烏苯美司及其衍生物之外，化合物1（圖3）也被選為開發(fā)降解劑的IAP抑制劑，因為它是現(xiàn)有二價IAP拮抗劑的一部分（圖3），如化合物20通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）招募IAP來降解RIPK2（圖8）[8]。

       圖8. 基于IAP設(shè)計的PIPK2的PROTAC

       05

       異型雙功能泛IAP降解劑

       E3連接酶不僅可以被用來設(shè)計PROTACs或SNIPERs，也可以作為靶標蛋白被降解，之前也已經(jīng)有很多異型雙功能降解劑被報道，如連接CRBN配體和VHL配體招募E3連接酶VHL，來降解CRBN蛋白的降解劑CRBN-6-5-5-VHL，或連接MDM2配體和CRBN配體招募E3連接酶CRBN，來降解MDM2蛋白的降解劑MD-224等（圖9）[9]。

       圖9. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       近期，Seulki等人在EJMC上報道了一類異型雙功能泛IAP降解劑，他們合成了十幾個化合物，并評估它們在MCF-7細胞中對cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最終發(fā)現(xiàn)化合物12（圖10）在0.1 mM和1 mM濃度時，對cIAP1、cIAP2和XIAP都有超過95%的降解（除了在0.1 mM對cIAP1有87%的降解）[4]。

       圖10. 化合物12（TD-1092）的結(jié)構(gòu)和降解活性

       而且，Yuen在JMC也發(fā)表了連接IAP配體和VHL配體或者CRBN配體，來設(shè)計異型雙功能泛IAP降解劑（圖11）[9]。

       圖11. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       他們設(shè)計了三種不同系列的異型雙功能降解劑，其中兩種與VHL配體不同位置連接而得，另一種與CRBN配體連接，從圖12可以看出大部分化合物對三種IAP蛋白有很明顯的降解功能。

       圖12. 三種不同類型的異型雙功能降解劑

       他們最終發(fā)現(xiàn)化合物9對三種IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明顯的降解作用，而且它對多種細胞系有很明顯的抑制生長作用（圖13）。

       圖13. 化合物9的結(jié)構(gòu)與活性

       06

       小結(jié)

       細胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細胞周期過程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細胞凋亡。但是，癌細胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡，最終導致腫瘤的生長、預后不良和耐藥性等問題。

       據(jù)預測到2030年，細胞凋亡市場規(guī)模有望達到36.3億美元，2022-2030年復合增長率達31.7%。

       細胞凋亡抑制蛋白是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細胞死亡（細胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。IAP可直接結(jié)合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，預防細胞凋亡。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類，其中Smac模擬物可依據(jù)結(jié)合位點的數(shù)目分為單體和二聚體抑制劑，包括LCL161、AT-406等；二聚體抑制劑可激活Caspase-3/7/9的活性，達到促進細胞凋亡的目的，包括APG-1387等。

       目前全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標，也可以作為E3連接酶設(shè)計SNIPERs降解靶標蛋白（化合物20通過UPS系統(tǒng)招募IAP來降解RIPK2），而且還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑（如異型雙功能泛IAP降解劑9和12）。