當(dāng)前核酸藥物開發(fā)可分為化學(xué)改造和物理改性兩大方向，二者可單獨或共同提升核酸藥物體內(nèi)外穩(wěn)定性和特定組織、細胞內(nèi)的翻譯效率。目前已開發(fā)出多種核酸改造和遞送技術(shù)，主要包括化學(xué)修飾、配體偶聯(lián)和納米遞送載體。

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       納米遞送載體

       1、無機納米載體

       無機納米載體是以無機物為主體的遞送系統(tǒng)，常用的無機納米材料有金、銀、磷酸鈣、氧化石墨烯、量子點和磁性納米材料如氧化鐵等。無機納米材料因其獨特的電學(xué)、光學(xué)性質(zhì)和生物相容性以及低細胞毒性的特點而備受關(guān)注。金納米材料具有柔性表面，可以使核酸直接與金納米粒結(jié)合。有學(xué)者利用i-motif 二級結(jié)構(gòu)制作一種pH敏感的siRNA-金納米粒遞送系統(tǒng)，可通過siRNA沉默 PLK1（編碼穩(wěn)定染色體和有絲分裂所必需的酶），進而誘導(dǎo)靶細胞凋亡。pH 梯度變化可引起核酸構(gòu)象改變，誘導(dǎo) siRNA-金納米粒聚集，促進體內(nèi)逃逸，從而釋放 siRNA。干細胞難以攝取外來物質(zhì)，很難使用傳統(tǒng)的非病毒載體進行藥物遞送。研究利用HIV-TAT肽對金納米粒和銀納米粒進行功能化修飾，載體可以有效穿透表皮干細胞，且毒性較低。量子點是一種基于半導(dǎo)體的單分散納米晶體，碳量子點是其中最典型的應(yīng)用之一，其尺寸通常小于 10 nm，碳量子點具有低毒性、高量子產(chǎn)率、低光漂白、良好的水溶性、易于表面修飾和化學(xué)性能穩(wěn)定的特點。PEI、乙二胺、精胺和精氨酸等表面修飾已廣泛應(yīng)用于碳量子點，且攜帶陽離子化合物的碳量子點可以有效地將治療性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中。碳量子點可用于癌癥靶向治療，利用葉酸修飾摻雜了氮的碳量子點，與自噬抑制劑組合，可實現(xiàn)快速（24 h內(nèi)）抑制腫瘤細胞生長且殺傷效果顯著。另外，碳量子點還可以作為一種高效的熒光探針，實現(xiàn)核酸標(biāo)記和體內(nèi)動態(tài)分布的實時跟蹤。例如用脂質(zhì)體包裹碳量子點可用于血管中腫瘤擴增的成像，運用碳量子點來遞送 siRNA 可進行“可視化”的肺癌治療。石墨烯是碳的同素異形體，由于其獨特的光學(xué)、熱學(xué)和電學(xué)特性，成為一種新型納米材料。氧化石墨烯存在 π-π 堆疊非共價相互作用，可以提高藥物裝載能力并實現(xiàn)受控釋放。由PEG、PEI 和氧化石墨烯組成的一種刺激響應(yīng)型核酸遞送載體，氧化石墨烯納米粒吸收近紅外輻射時，局部溫度升高，導(dǎo)致內(nèi)體破裂，實現(xiàn)受控釋放。同時，氧化石墨烯具有較高負載力，可以將氧化石墨烯、PEI 和聚 4-苯乙烯磺酸鈉組裝成納米復(fù)合物來同時遞送 miRNA 藥物和抗癌藥物阿霉素。

       2、脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)

       基于脂質(zhì)的納米載體是核酸藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點。脂質(zhì)本身即是細胞膜的主要成分，其易于與細胞膜的磷脂雙分子層相融合，可以提高納米載體的細胞攝入。而且，脂質(zhì)易于購買、生物相容性好、可生物降解，還可以通過化學(xué)修飾提高載體靶向性。目前研究涉及的脂質(zhì)納米載體包括脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplex）、脂質(zhì)聚合物復(fù)合物（lipopolyplex）、層狀納米顆粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC），以及穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

       ①脂質(zhì)復(fù)合物。通過電性吸引將核酸藥物與陽離子脂質(zhì)，如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（DOTMA）等混合后直接形成脂質(zhì)復(fù)合物是最簡單的遞送思路。脂質(zhì)復(fù)合物的表面帶正電荷，便于結(jié)合帶負電荷的細胞膜繼而進入細胞，但其在體內(nèi)環(huán)境中會與帶負電荷生物大分子發(fā)生作用，導(dǎo)致帶負電荷的核酸藥物被置換從而發(fā)生泄漏，同時產(chǎn)生電荷相關(guān)的生理毒性。另外，脂質(zhì)復(fù)合物劑型穩(wěn)定性不理想，需要在使用前即時配制。

       ②脂質(zhì)聚合物復(fù)合物。脂質(zhì)聚合物復(fù)合物系將陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺樹形分子（PAMAM dendrimer）等與核酸藥物形成的表面帶正電的聚合物復(fù)合物通過電性吸引包裹脂質(zhì)雙分子層得到，形成的納米顆粒表面基本不帶正電荷。相較于脂質(zhì)復(fù)合物，脂質(zhì)體聚合物復(fù)合物可以顯著提高遞送效率，且穩(wěn)定性明顯提高。通過加入透明質(zhì)酸或肝素對復(fù)合物表面進行修飾，其免疫刺激性可進一步降低。

       ③層狀納米顆粒。層狀納米顆粒通過序列的電性作用將核酸藥物包裹進多層的納米顆粒。中心穩(wěn)定的納米核心及各層材料的選擇對相鄰層之間的吸附至關(guān)重要。如使用電負性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）顆粒作為核心，首先將聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以產(chǎn)生帶正電荷的表面，再以電負性的siRNA 進行覆蓋，再覆蓋一層帶正電荷的聚精氨酸，最后用偶聯(lián)了 CD20 抗體的帶負電荷的透明質(zhì)酸覆層。該多層納米顆粒最外層的負電荷層可以避免產(chǎn)生正電荷相關(guān)毒性，其在動物實驗中未見明顯的毒性。但層狀納米顆粒的材料選擇要求較高且制備工藝復(fù)雜、重現(xiàn)性差，限制了其應(yīng)用。

       ④固體脂質(zhì)納米粒（SLN）和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。固體脂質(zhì)納米粒具有低熔點的固體陽離子脂質(zhì)核心，核酸藥物吸附于載體基質(zhì)表面，通過外圍的表面活性劑使之穩(wěn)定。但研究發(fā)現(xiàn)，SLN 可能會隨著內(nèi)部固體脂質(zhì)晶體的逐漸生長導(dǎo)致藥物泄漏。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為其升級版本，在基質(zhì)中摻入少量的液體脂質(zhì)，降低了脂質(zhì)核心的結(jié)晶程度，不僅提高了載藥量，還具有更好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。由于固態(tài)脂質(zhì)核也可進行載藥，固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可以對親脂性藥物進行遞送。使用固體脂質(zhì)納米粒對Bcl-2 siRNA 和紫杉醇同時包載，體外結(jié)果顯示這2種藥物可以同時釋放。

       ⑤穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子。穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（SNALP）是一種含有可離子化陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒（LNP），由正電/可離子化脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、PEG 脂質(zhì)及膽固醇組成，可有效阻止核酸藥物在內(nèi)源性環(huán)境中的降解，將藥物遞送至細胞內(nèi)?；谄浼夹g(shù)和商業(yè)上的成功導(dǎo)致的巨大影響，許多文獻中的LNP均特指SNALP。LNP粒徑通常為20～200 nm，該大小可幫助LNP 克服體液 (如血液和淋巴液) 的剪切并穿過組織間隙。研究表明，LNP 在體內(nèi)主要通過與載脂蛋白E (apoli‐poprotein E，ApoE) 形成復(fù)合物，在低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞后由CLs/ILs 介導(dǎo)的內(nèi)體逃逸進入細胞質(zhì)。LNP 的體內(nèi)分布與處方及相關(guān)受體密切相關(guān)，LNP 的處方研究是當(dāng)前 RNA 遞送的研究熱點和難點。

       目前，已有3個使用此類遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品獲批上市，分別為阿尼拉姆公司開發(fā)的治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的 siRNA 藥物 patisiran（商品名：Onpattro），以及用于預(yù)防新冠病毒感染的mRNA疫苗 Comirnaty 和 Spikevax。可離子化陽離子脂質(zhì)的使用和微流控混合技術(shù)的出現(xiàn)使得載藥顆粒的表面基本不帶電。可離子化陽離子脂質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，而在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境中幾乎不帶電。脂質(zhì)納米粒制備時，在pH 約4的條件下，通過快速混合脂質(zhì)的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成實心的脂質(zhì)顆粒。將其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存?zhèn)溆茫|(zhì)顆粒表面近中性。

       SNALP 通過一系列巧妙的設(shè)計獲得了商業(yè)上的成功，但其存在的問題也比較明顯。首先，其遞送效率有限，為達到治療效果需要較高的給藥劑量。但是，作為一種使用了多種脂質(zhì)輔料的注射劑，輔料的毒性不可忽視。另外，PEG 脂質(zhì)被報道可引起超敏反應(yīng)，陽離子脂質(zhì)也具有一定的促炎性。例如，Onpattro 在注射之前需要使用抗組胺藥和激素藥物控制。隨著同樣靶向肝臟的更高效遞送系統(tǒng)-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)，SNALP 已逐漸退出 siRNA遞送領(lǐng)域。但對于生物利用度更差、荷電更高的mRNA及CRISPR 基因編輯藥物，LNP遞送系統(tǒng)目前仍是解決其遞送難題最有效的方式。

       經(jīng)過近半個世紀(jì)的積累，遞送技術(shù)逐漸成熟，使核酸藥物進入了快速增長期。核酸藥物在治療遺傳性疾病方面具有天然優(yōu)勢，為眾多罕見病患者提供了寶貴的治療機會。核酸藥物遞送技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)出平臺化的特點，在遞送技術(shù)相對成熟后，基于相同技術(shù)平臺開發(fā)類似藥物的速度會明顯加快。如借助前期脂質(zhì)納米粒的技術(shù)沉淀，Moderna公司的mRNA 新冠疫苗從疫苗序列選擇設(shè)計完成到首次人體給藥，合計僅耗時63 d，展現(xiàn)了超乎以往想象的效率?？梢灶A(yù)見，已有的技術(shù)平臺未來也非常有希望應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯等新的治療領(lǐng)域。同時，核酸藥物的遞送仍面臨眾多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何進一步提高遞送效率、降低遞送系統(tǒng)的毒性、實現(xiàn)對其他肝臟外組織和器官的特異性遞送將是該領(lǐng)域的研究熱點。伴隨著對核酸體內(nèi)作用機制和相關(guān)疾病認識的進一步深入，核酸藥物遞送系統(tǒng)必將迎來新的突破和發(fā)展，助力于提供安全有效的個性化治療方案，使更多患者受益。

       參考資料

       [1]陳歡，魏利軍.RNA藥物非病毒遞送系統(tǒng)研究進展[J].藥學(xué)進展，2022，46(11):

       [2]李丹，黃宇坤，高小玲.RNA藥物遞送研究進展[J].藥學(xué)學(xué)報，2023，58(03):

       [3]王峻峰，譚曼曼，王穎等.核酸類藥物的修飾和遞送研究進展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2023，52(04):

       作者簡介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證