作為一種重要的藥物模態(tài)，寡核苷酸的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域在未來(lái)幾年將持續(xù)加強(qiáng)拓展。寡核苷酸藥物是一類(lèi)由短核苷酸序列（DNA和RNA的組成部分）組成的治療藥物，它的進(jìn)步引導(dǎo)了基因表達(dá)控制的新機(jī)制，通過(guò)藥物控制對(duì)基因表達(dá)水平，抑制致病蛋白的生成。

        寡核苷酸藥物開(kāi)發(fā)流程：

        01 靶標(biāo)識(shí)別

        寡核苷酸藥物靶向那些參與疾病過(guò)程的特定基因、信使RNA（mRNA）或非編碼 RNA（例如microRNA）。靶標(biāo)識(shí)別是開(kāi)發(fā)這些藥物的關(guān)鍵步驟。

        02 序列設(shè)計(jì)

        寡核苷酸藥物，從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是依照靶標(biāo)RNA來(lái)設(shè)計(jì)的，它的核苷酸序列與靶標(biāo)RNA互補(bǔ)。這賦予了它們高度的結(jié)合特異性。

        03 與靶標(biāo)RNA結(jié)合

        寡核苷酸藥物一旦進(jìn)入體內(nèi)，就會(huì)在血液中循環(huán)，通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)選擇性地與目標(biāo)RNA分子結(jié)合。這種親和作用可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)生：

• mRNA降解：一些寡核苷酸藥物能夠觸發(fā)靶標(biāo)mRNA的降解。當(dāng)這種寡核苷酸藥物與mRNA結(jié)合時(shí)，它可以招募細(xì)胞酶來(lái)降解RNA分子，阻止其翻譯成蛋白質(zhì)。

• 阻斷翻譯：某些寡核苷酸藥物可以物理阻礙核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，或者干擾其他翻譯過(guò)程，阻斷mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。

• 剪接調(diào)節(jié)：如果寡核苷酸藥物的靶標(biāo)是前信使RNA（Precursor mRNA），這些藥物可以影響選擇性剪接。通過(guò)與特定的剪接位點(diǎn)結(jié)合，它們可以促進(jìn)特定外顯子的包含或排除，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞型的改變。

• RNA干擾(RNAi)：一些寡核苷酸藥物可以通過(guò)RNA干擾機(jī)制發(fā)揮藥效。它們被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC，RNA-induced silencing complex）中，并引導(dǎo)RISC尋找目標(biāo)mRNA，導(dǎo)致其降解或翻譯抑制。

        04 對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響

        通過(guò)調(diào)節(jié)靶標(biāo)RNA，寡核苷酸藥物可以降低致病蛋白的產(chǎn)生水平。通常用于治療由蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)剩或者功能障礙引起的各種遺傳性疾病和罕見(jiàn)疾病。

        值得注意的是，寡核苷酸藥物在治療各種疾病方面顯示出光明的前景，包括：遺傳性疾病、神經(jīng)退行性疾病和某些類(lèi)型的癌癥，尤其是在很多傳統(tǒng)上被認(rèn)作“不可成藥”的靶標(biāo)上，可以發(fā)揮關(guān)鍵的作用。然而，它們的開(kāi)發(fā)可能很復(fù)雜，并且可能有局限性和潛在的副作用，在臨床使用中需要仔細(xì)考慮。

01

反義寡核苷酸

        反義寡核苷酸（ASO，Antisense oligonucleotides）是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的單鏈DNA或RNA分子片段，長(zhǎng)度通常為15-30個(gè)核苷酸，通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則與內(nèi)源性mRNA靶標(biāo)特異性結(jié)合。ASO包括反義RNA（asRNA）和反義DNA（asDNA）。

        從類(lèi)藥性角度考慮，通常需要對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以保證生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，增加抑制mRNA靶標(biāo)的效力。

        ASO的作用機(jī)制包括：翻譯抑制、mRNA降解、剪接調(diào)節(jié)。它可以應(yīng)用在基因沉默，治療某些遺傳性疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病之中。ASO在治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和某些癌癥方面，顯示出良好的前景。例如，nusinersen（Spinraza）就是一種被批準(zhǔn)用于治療SMA的ASO。

        1 硫代磷酸酯寡核苷酸

        硫代磷酸酯（Phosphorothioates）是寡核苷酸藥物最初的主鏈修飾方式。Fomivirsen（商品名Vitravene，圖1）是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人類(lèi)治療的反義寡核苷酸藥物。它是一種硫代磷酸酯寡核苷酸衍生物的抗病毒藥物，治療巨細(xì)胞病毒引起的視網(wǎng)膜炎，這種疾病出現(xiàn)在一些艾滋病患者中，如果不進(jìn)行干預(yù)治療會(huì)導(dǎo)致患者失明。

        硫代磷酸酯的主鏈修飾，延長(zhǎng)了寡核苷酸在血清中的半衰期，促進(jìn)其與血清蛋白的結(jié)合，增加細(xì)胞攝取，指導(dǎo)核糖核酸酶H降解靶標(biāo)mRNA。

圖1. Fomivirsen化學(xué)結(jié)構(gòu)（紅色部分為一個(gè)硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)），來(lái)源：Wikipedia

        2 Aptamer（適配體）

        適配體既可以是單鏈DNA、RNA分子，也可以是多肽分子，它們具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，能夠選擇性地結(jié)合特定的靶分子，例如蛋白質(zhì)、核酸、小分子，甚至細(xì)胞。適配體有時(shí)被稱為“化學(xué)抗體”，因?yàn)樗鼈兡軌蛞愿咛禺愋院陀H和力識(shí)別并結(jié)合其靶標(biāo)。適配體與抗體相比具有多種優(yōu)勢(shì)，包括尺寸更小、易于合成以及修飾潛力。當(dāng)在體內(nèi)使用時(shí)，它們通常也不會(huì)引起免疫反應(yīng)。

        就寡核苷酸來(lái)說(shuō)，適配體是無(wú)毒且非免疫原性的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，長(zhǎng)度在 20至80個(gè)核苷酸之間。這些aptamer分子可能具有與抗體相似的結(jié)合親和力，并且可以大規(guī)模合成、修飾，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)特性。

        Pegaptanib（商品名 Macugen）是目前唯一被批準(zhǔn)用于人類(lèi)治療的aptamer（有幾種aptamer正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)）。Pegaptanib分子中的寡核苷酸與聚乙二醇（PEG） 化學(xué)連接（圖2），用于治療新生血管（濕性）年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD），2004年12月獲得FDA批準(zhǔn)。

圖2. Pegaptanib化學(xué)結(jié)構(gòu)

        Pegaptanib與血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng) 因 子（VEGF）具有高親和力。Pegaptanib特異性結(jié)合 VEGF的165亞型，后者是一種在血管生成和滲透性增加（血管滲漏）中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，這是兩個(gè)AMD的主要病理過(guò)程。Pegaptanib是VEGF的拮抗劑，注射到眼睛后會(huì)阻斷VEGF的作用，減少眼內(nèi)血管的生長(zhǎng)，有助于控制滲漏和腫脹。

        3 Gapmer

        Gapmer技術(shù)代表了第二代寡核苷酸藥物。Gapmer是短DNA或RNA反義寡核苷酸，向寡核苷酸分子中，引入2'-O-烷基（以及其它修飾）結(jié)構(gòu)。這種修飾增加了反義寡核苷酸對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性，不過(guò)這些衍生物不被核糖核酸酶H（RNAse-H酶）識(shí)別。這個(gè)問(wèn)題可以被Gapmer技術(shù)化解：Gapmer分子的中央部分并未進(jìn)行2'-O-烷基（或其他修飾基團(tuán)）修飾，因此該部分可以保留與RNAse-H酶的高親和力，而它們的突出端可以通過(guò)2'-O-烷基修飾進(jìn)行改性。

        Gapmer與目標(biāo)RNA片段雜交，通過(guò)招募RNAse-H酶，通過(guò)其裂解作用來(lái)沉默該目標(biāo)基因。由于遭修飾的RNA側(cè)翼區(qū)域提高了它對(duì)核酸酶降解的抵抗力，因此，gapmer與靶標(biāo)的結(jié)合具有更高的親和力和生物活性（圖3）。Gapmer目前正在被開(kāi)發(fā)用于治療多種癌癥、病毒和其他慢性遺傳性疾病。

圖3. Gapmer作用機(jī)制，來(lái)源：Wikipedia by Biomolenguofu

        Gapmer化學(xué)修飾增加它對(duì)核酸酶降解的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)LNA、2'-OMe或2'-F修飾的堿基（圖4），衍生出天然RNA的化學(xué)類(lèi)似物。這些修飾可以增強(qiáng)核酸的酶抗性、降低免疫原性并降低毒 性。Gapmers還可以產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)mRNA更高的親和力，這種高親和力減少了脫靶效應(yīng)、非特異性結(jié)合和不需要的基因沉默。

圖4. 涉及2'-位置的寡核苷酸化學(xué)修飾，來(lái)源：Chemistry Today

        Mipomersen（商品名Kynamro）是一種20個(gè)堿基的gapmer，抑制載脂蛋白B，于 2013年獲批通過(guò)。Mipomersen通過(guò)降低低密度脂蛋白來(lái)治療高脂血癥。Mipomersen分子中，核苷酸以硫代磷酸酯鍵連接，而不是傳統(tǒng)的磷酸二酯鍵；糖部分進(jìn)行了2'-O-甲氧基乙基修飾（圖5）。這些修飾使藥物能夠抵抗核酸酶的降解，從而實(shí)現(xiàn)每周給藥一次的頻率。

圖5. Mipomersen化學(xué)結(jié)構(gòu)（修飾的核苷酸處于分子兩翼），來(lái)源：Wikipedia

        其他Gapmer包括：2018年獲批治療運(yùn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性的Inotersen（Tegsedi），以及2019年批準(zhǔn)用于治療家族性乳糜微粒血癥綜合征的 Volanesorsen （Waylivra）。

        4 外顯子跳躍的RNA剪接調(diào)節(jié)劑寡核苷酸

        反義寡核苷酸也可以設(shè)計(jì)為與剪接區(qū)域互補(bǔ)的序列，用來(lái)治療遺傳性疾病。這個(gè)策略可以治療剪接缺陷的疾病，允許誘導(dǎo)外顯子排除或外顯子包含。

        在分子生物學(xué)中，外顯子跳躍是RNA剪接的一種形式，用于“跳過(guò)”遺傳密碼的錯(cuò)誤外顯子部位。盡管外顯子跳躍導(dǎo)致了基因改變，但變化后的基因仍能形成截短的蛋白質(zhì)，而這個(gè)截短的蛋白質(zhì)仍然可以發(fā)揮生物學(xué)功能。

        基因由內(nèi)含子和外顯子組成。外顯子是DNA的一部分，包含生成蛋白質(zhì)的指令集。它們的片段周?chē)⒉贾鴥?nèi)含子非編碼區(qū)域。在蛋白質(zhì)制造之前去除內(nèi)含子，僅留下編碼外顯子區(qū)域。

        對(duì)于那些產(chǎn)生基因突變的外顯子，可以用ASO與前信使RNA中的突變位點(diǎn)結(jié)合，以誘導(dǎo)外顯子跳躍。ASO與突變的外顯子結(jié)合，因此當(dāng)該基因從成熟的mRNA翻譯時(shí)，它會(huì)被“跳過(guò)”，從而恢復(fù)被破壞的基因閱讀框。這個(gè)過(guò)程產(chǎn)生了內(nèi)部缺失但主要功能仍然保留的蛋白質(zhì)。這種機(jī)制被用于治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中。

        這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的寡核苷酸藥物包括Eteplirsen（Exondys 51），Nusinersen （Spinraza），Golodirsen （Vyondys 53），Vitolarsen （Viltepso），Casimersen（Amondys 45）。這些寡核苷酸經(jīng)過(guò)硫代磷酸酯鍵和2'-O-烷基-RNA（尤其是甲氧基乙基，MOE）的化學(xué)修飾。

        PMO（Phosphorodiamidate morpholino oligomers，磷酸二酰胺嗎啉低聚物）是一種重要的ASO修飾物。PMO是合成DNA類(lèi)似物，能夠抑制基因表達(dá)。PMO的主鏈?zhǔn)菃徇h(huán)，通過(guò)磷酸二酰胺鍵連接（圖6）。作為不帶電荷的核酸類(lèi)似物，PMO通過(guò) Watson-Crick堿基配對(duì)與目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)空間封鎖來(lái)阻止蛋白質(zhì)翻譯。PMO對(duì)生物體液中存在的多種酶具有抵抗力。值得注意的是，基于PMO的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）療法Eteplirsen（圖7），已獲得FDA批準(zhǔn)，成為基于 PMO的反義療法的里程碑事件。

圖6. DNA（單鏈）與PMO化學(xué)結(jié)構(gòu)比較，圖片來(lái)源：Front. Microbiol.

圖7. Eteplirsen化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖，圖片來(lái)源：Wikipedia

02

RNA干擾和治療性siRNA

• RNA干擾（RNAi，RNA interference）

        RNA干擾途徑是一種自然調(diào)節(jié)過(guò)程，通過(guò)小尺寸雙鏈RNA（dsRNA）下調(diào)基因表達(dá)。通常分為三個(gè)類(lèi)型：

        小干擾 RNA (siRNA，small interfering RNA)

        微小 RNA (miRNA，microRNA) 

        Piwi 相互作用 RNA (piRNA)

        基于RNAi的療法，涉及將合成的小RNA雙鏈體（例如siRNA、人工miRNA和小發(fā)夾 RNA (shRNA)）遞送到確定的靶細(xì)胞中，產(chǎn)生基因沉默效果。

        這些小RNA分子連接并激活蛋白質(zhì)復(fù)合物，尤其是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RISC)。一旦結(jié)合，它們就可以與目標(biāo)mRNA 結(jié)合，并在物理上阻止核糖體繼續(xù)合成相關(guān)蛋白質(zhì)，標(biāo)記該mRNA以進(jìn)行破壞。RNA干擾可以在mRNA自然降解之前將其破壞，終止致病路線。

        RNA干擾還可以在細(xì)胞合成機(jī)器制造病毒蛋白之前，攻擊細(xì)胞的mRNA，有時(shí)甚至攻擊基因組，從而保護(hù)細(xì)胞免受病毒侵害。

03

寡核苷酸藥物遞送

        同很多大分子藥物一樣，寡核苷酸療法面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)在于藥物遞送，特別是基于RNA的藥物遞送，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞攝取通常效率差，而且在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性低。

        使用脂質(zhì)制劑可以解決這一問(wèn)題，或者制備含有識(shí)別分子的綴合物。例如Patisiran （Onpattro），針對(duì)遺傳性運(yùn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性引起的多發(fā)性神經(jīng)病。Patisiran是第一個(gè)被批準(zhǔn)此適應(yīng)癥的siRNA藥物，通過(guò)利用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 將藥物直接輸送到肝 臟。

        Givosiran（Givlaari）的獲批用于治療人肝卟啉癥，這是一個(gè)具有里程碑意義的事件，因?yàn)檫@是首次使用N-乙酰半乳糖胺三聚體（GalNAc，圖 8）主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA藥物至肝 臟，siRNA分子抑制氨基乙酰丙酸合酶。該制劑通過(guò)皮下注射，使siRNA在靶肝細(xì)胞中積累。它的成功催生了其他幾種siRNA的藥渡遞送路徑，例如Inclisiran （Leqvio），Lumasiran（Oxlumo），以及Vutrisiran或Amvuttra。

圖8. GalNAc三聚體化學(xué)結(jié)構(gòu)，來(lái)源：Chemistry Today

●展望●

        寡核苷酸代表的新療法正在大步向前，前進(jìn)道路上的目標(biāo)主要涉及尋找和開(kāi)發(fā)新的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

        孕育新藥的領(lǐng)域之一，在于使用寡核苷酸作為microRNA的調(diào)節(jié)劑。miRNA的失調(diào)與許多人類(lèi)疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病。合成miRNA在調(diào)節(jié)內(nèi)源miRNA表達(dá)的領(lǐng)域中大有可為。miRNA療法可分為兩大策略：

        1）miRNA模擬物（激動(dòng)劑，dsRNA）：用于恢復(fù)受抑制的miRNA水平；

        2）內(nèi)源性miRNA抑制劑（拮抗劑，ssRNA），稱為antimiRNA或antagomir，下調(diào)過(guò)度活躍的miRNA表達(dá)。

        在三聚體的GalNAc作為遞送物質(zhì)，成功將寡核苷酸藥物靶向肝細(xì)胞后，這個(gè)領(lǐng)域的研發(fā)熱情已經(jīng)被帶動(dòng)起來(lái)，其中的一個(gè)熱點(diǎn)是制備用于肝外遞送的新型寡核苷酸偶聯(lián)物，尤其是多肽-寡核苷酸和脂質(zhì)-寡核苷酸綴合物的開(kāi)發(fā)。由小分子和寡核苷酸組合形成的偶聯(lián)物新實(shí)體也很重要，這些小分子可以通過(guò)受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)藥物的細(xì)胞攝取，也可以通過(guò)protac（蛋白降解靶向嵌合體）降解途徑誘導(dǎo)蛋白水解。適配體（Aptamer）也代表著寡核苷酸藥物開(kāi)發(fā)的一種重要方向。

        DNA納米技術(shù)將是另一個(gè)錦上添花的領(lǐng)域，它可以為治療和診斷提供精細(xì)的納米結(jié)構(gòu)，從而改善寡核苷酸藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。

        最后，寡核苷酸行業(yè)將面臨一個(gè)重要挑戰(zhàn)，它來(lái)自CMC領(lǐng)域，即以更少的試劑和溶劑消耗生產(chǎn)寡核苷酸藥物。在更環(huán)保的條件下優(yōu)化生產(chǎn)，將是寡核苷酸工業(yè)界CMC未來(lái)幾年的主要方向。

        參考資料：

        1. Lee, J. Antisense PMO cocktails effectively skip dystrophin exons 45-55 in myotubes transdifferentiated from DMD patient fibroblasts. PLoS One. 2018; 13(5): e0197084.

        2. Extance, A. Oligonucleotide drugs step up. Chemistry World. 23. 09. 2015.

        3. Nan, Y. et al. Antisense Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers as Novel Antiviral Compounds. Front. Microbiol. 2018, 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00750

        4. Oligonucleotide Therapeutics. A Long And Windy Road Towards Future Medicines. 2023. 41. 12-15.