伴隨著全球的新冠大流行，新冠疫苗備受關(guān)注。目前市面上的新冠疫苗有三個類型：傳統(tǒng)滅活疫苗、腺病毒載體疫苗以及信使RNA (mRNA)疫苗。傳統(tǒng)的滅活疫苗我們比較了解，它是將經(jīng)過處理、沒有傳染性和致病性的病原體注入人體，讓免疫系統(tǒng)認識這種病原體，從而達到預防的目的。腺病毒載體疫苗是用另外一種非復制型的病毒將想要免疫的病原體DNA注入人體。相較于這兩種疫苗，mRNA疫苗更具設計與制造的簡便性、固有的免疫原性、快速量產(chǎn)性等優(yōu)勢。

       而且隨著生物技術(shù)和分子醫(yī)學的快速發(fā)展，mRNA引入人體作為疫苗或治療劑能夠產(chǎn)生幾乎所有功能性蛋白，這代表著一個精準醫(yī)學領(lǐng)域正在崛起，其在預防和治療許多難治性疾病方面前景廣闊。因此，小編今天和大家分享之前發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上（IF:18.817）的關(guān)于mRNA治療的綜述，為大家進一步介紹mRNA治療的現(xiàn)狀。

基于mRNA的治療：對抗疾病的強大和通用工具

01

mRNA的設計與制造

        mRNA治療的發(fā)展主要包括mRNA的設計、合成、包封、藥效學、藥代動力學、體內(nèi)和體外安全性評價、生產(chǎn)和臨床試驗(圖2，表1)。其中mRNA的設計和合成是關(guān)鍵步驟，想要獲得高度生物活性RNA也通常依賴于可靠的設計。因此，在這一部分，作者重點關(guān)注并討論了mRNA設計和制造。并從以下幾點進行了介紹：

       1 mRNA的結(jié)構(gòu)成分

       要了解mRNA治療，首先要了解mRNA結(jié)構(gòu)。mRNA是由轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生的，真核生物中RNA聚合酶在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)化為初級mRNA轉(zhuǎn)錄本時合成前體mRNA，通過加工進一步成為成熟mRNA 。成熟mRNA包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)（UTR）、poly(A)尾和5′帽結(jié)構(gòu)，它們可以被核糖體識別并被tRNA攜帶產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

       與DNA一樣，mRNA中的遺傳信息包含在核苷酸序列中，這些核苷酸排列成密碼子，每個密碼子由三個核糖核苷酸組成。因此，通過刺激真核細胞mRNA合成機制來完成體外RNA轉(zhuǎn)錄，能夠確保mRNA在體內(nèi)的表達(圖3)。所以mRNA的優(yōu)化對于成功的mRNA治療至關(guān)重要。

       2 mRNA翻譯和衰變

       真核mRNA翻譯起始是一個精細調(diào)控的過程，涉及到組裝一個多蛋白及RNA復合物，指導核糖體到起始密碼子。而mRNA在核糖體中會被解碼，產(chǎn)生特定的氨基酸鏈。研究發(fā)現(xiàn)翻譯過程和mRNA衰變過程之間存在一種平衡（圖4）。先前的研究表明，結(jié)構(gòu)元件與mRNA的衰變密切相關(guān)，尤其是5 '帽和poly(A)尾?；谶@些功能元件的重要性，有大量研究集聚焦于mRNA結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，如開發(fā)一系列5 '帽類似物、改變poly(a)尾長度等。

       3 mRNA設計 

       這一部對mRNA設計進行了介紹。首先介紹的是5 '帽。5 '帽位于mRNA的5 '端，甲基化程度不同（圖5），許多mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略致力于優(yōu)化帽類似物。接著介紹的是poly(A)尾。Poly(A)尾通常由10-250個腺嘌呤核糖核苷酸組成。Poly(A)尾是mRNA的動態(tài)添加物，其的長度對mRNA翻譯效果和蛋白表達起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。

       此外，作者也介紹了5′-UTRs和3′-UTRs。mRNA 3′和5′末端的UTRs不編碼蛋白但在調(diào)控mRNA翻譯和蛋白表達中起重要作用。UTRs參與mRNA的亞細胞定位，調(diào)節(jié)mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性。5′-UTRs和3′-UTRs共同調(diào)控蛋白質(zhì)的表達水平，5′-UTRs主要參與啟動翻譯過程，而3′-UTRs主要影響mRNA的穩(wěn)定性和半衰期。作者也對開放閱讀框（ORF）進行了介紹，ORF的設計主要集中在密碼子的優(yōu)化和功能肽的引入以及復制過程。 

       4 RNA化學式設計

       這一部分作者主要介紹了兩類RNA。首先是自擴增RNA (Self-amplifying RNA, saRNA)：與傳統(tǒng)mRNA相比，saRNA是另一種結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子。saRNA主要來源于甲病毒，通過替換病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列編碼來構(gòu)建。因此，saRNA可以利用甲病毒的先天特性，以一種有效的方式產(chǎn)生大量感興趣的蛋白質(zhì)。

       其次是環(huán)狀RNA、非編碼RNA和競爭性內(nèi)源RNA：環(huán)狀RNA (circRNAs)是單鏈、共價閉合的RNA分子，在從病毒到哺乳動物中普遍存在。CircRNAs可作為蛋白質(zhì)誘餌、支架和招募者，通過充當轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、microRNA海綿和蛋白質(zhì)模板發(fā)揮生物功能。環(huán)狀RNA 獨特的結(jié)構(gòu)使其具有更大的穩(wěn)定性、更長的半衰期和更大的RNase R抗性，這是線性mRNA缺乏和期望的。

       5 mRNA的制造 

       針對mRNA的制造，作者主要對RNA的合成與優(yōu)化進行了介紹。體外轉(zhuǎn)錄(IVT) mRNA是用線性化質(zhì)粒DNA模板或PCR模板進行的，需要至少一個啟動子和相應的mRNA構(gòu)建序列。獲得mRNA的過程需要加帽，通常采用兩種方法：共轉(zhuǎn)錄加帽和轉(zhuǎn)錄后加帽。而IVT mRNA的Poly(A)尾通常編碼在DNA模板中或通過酶促作用附著在IVT mRNA上。當poly(A)尾延伸編碼在模板載體中時，會出現(xiàn)懸臂，這妨礙了IVT mRNA的翻譯效果，需要通過IIS型限制性內(nèi)切酶替換II型限制性內(nèi)切酶來避免。

       6 mRNA純化

       IVT mRNA合成后會與RNA聚合酶和DNA模板混合，因此純化IVT mRNA是必要的，包括去除免疫刺激污染物，游離核糖核苷酸，短mRNA和DNA模板。一般情況下，會用DNA酶降解多余的DNA模板。商業(yè)純化試劑盒則用于純化和分離合成的mRNA，然后乙醇或異丙醇沉淀可以去除大部分污染物，以獲得高純度的mRNA，然后用高濃度的LiCl或醇基沉淀、色譜法，或從硅膠膜柱中洗脫，可以去除蛋白質(zhì)、游離核苷酸及其他成分，但不能去除dsRNA雜質(zhì)。為了去除轉(zhuǎn)錄反應液中的dsRNA污染物，一種新的純化方法RNase III被提出，其能夠顯著降低mRNA的免疫原性。

       綜上所述，純化mRNA的方法多種多樣，純度要求和尺度不同，應根據(jù)研究或應用的目的而定。顯然，無論使用何種方法進行純化，嚴格的mRNA質(zhì)量控制是確保mRNA治療最大效益的核心。

02

mRNA運載系統(tǒng)

       mRNA的傳遞仍然是當前基于mRNA治療的一個巨大挑戰(zhàn)。因此在文章的第二大部分作者列出了多種mRNA運載系統(tǒng)，并從多個角度對運載系統(tǒng)進行了介紹。

       1 mRNA運載體

       文章首先就對運載mRNA的脂質(zhì)納米粒進行介紹（圖6）。首先介紹的是陽離子固體脂質(zhì)納米粒，陽離子脂類廣泛用于mRNA傳遞。接著作者又介紹了可電離脂質(zhì)納米顆粒，有研究已經(jīng)將可電離的氨基脂質(zhì)Dlin-MC3- DMA (MC3)用于臨床治療。接著介紹的是具有免疫刺激作用的脂質(zhì)納米顆粒，有研究開發(fā)了具有環(huán)狀氨基頭基團的脂質(zhì)，可激活細胞內(nèi)STING通路，會顯著延長了生存期，增強了抗腫瘤療效。

       其次是，聚合物納米顆粒：聚合化合物及其衍生物可以由天然或合成材料合成，具有多種可能的結(jié)構(gòu)和特性。其中PEI是最有效的非病毒基因載體之一。此外還有，陽離子納米乳劑：1990年，CNEs被提出作為一種潛在的核酸輸送系統(tǒng)，已被證明可以有效地輸送核酸用于各種疾病的治療。其中在配方中加入陽離子脂質(zhì)是通過靜電作用進行核酸絡合的必要條件，這對于提高核酸的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率，防止核酸被核酸酶降解也是必不可少的。

       最后是，其他mRNA傳遞系統(tǒng)：也有一些其他類型的載體被開發(fā)用于傳遞mRNA，其中包括精蛋白濃縮mRNA、外泌體、細胞外囊泡(ev)、介孔二氧化硅、CaP等。

       2 影響mRNA運載的其他因素 

       接下來文章對影響mRNA運載系統(tǒng)的其他因素進行了介紹。其中包括：體外和體內(nèi)mRNA傳遞的屏障，mRNA傳遞的屏障一直是該領(lǐng)域思考的重點，研究者通過增加細胞攝取，促進溶酶體逃逸，加速翻譯來最大限度地提供mRNA。研究發(fā)現(xiàn)mRNA在納米顆粒的幫助下進入細胞質(zhì)涉及多個步驟:包括內(nèi)吞作用、溶酶體逃逸和mRNA釋放，其中細胞膜是細胞內(nèi)運輸?shù)囊粋€動態(tài)和強大的屏障。而納米顆粒會通過多種機制與細胞膜相互作用。

       此外，了解mRNA的細胞攝取機制是mRNA高效傳遞的前提。mRNA傳遞系統(tǒng)的佐劑活性：陽離子脂質(zhì)體本身作為佐劑，其主要功能是保護抗原不被清除，并將抗原傳遞給專業(yè)的APCs。管理路徑對傳遞效率的影響：給藥途徑在mRNA給藥系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，因為一些特定的疾病需要特定的給藥途徑，盡管靜脈給藥可以滿足大多數(shù)疾病的需要，但肺部疾病等則宜采用吸入或氣管內(nèi)給藥。此外，不同給藥載體在不同給藥路徑下的分布或表達也不同。

       03 mRNA治療的應用

       基于mRNA的治療有望成為多種難治性疾病的有力治療手段，包括傳染性疾病、代謝性遺傳疾病、癌癥、心腦血管疾病和其他疾病(圖7，表2)。因此，在這一部分作者對mRNA治療的應用進行了詳細介紹。主要包括以下幾種：

       1 直接基于編碼分子的mRNA療法

       以mRNA為基礎的免疫治療通過表達抗原然后啟動免疫反應，被定義為一種間接治療，其不以病毒或腫瘤細胞的mRNA編碼治療蛋白。而mRNA療法通過傳遞基于mRNA的功能性蛋白直接治療疾病則是一種直接策略，這些功能蛋白主要包括缺失或下調(diào)內(nèi)源性蛋白、功能性外源蛋白或抗體，以及用于基因編輯工具的蛋白。

       2 基于mRNA單克隆抗體及免疫療法 

       以抗體為基礎的藥物在生物制藥領(lǐng)域取得了快速的進展，但單克隆抗體的脆弱特性以及高昂的生產(chǎn)、儲存、運輸和分銷成本限制了其在世界范圍內(nèi)的應用。核酸編碼的單克隆抗體，特別是基于mRNA的單克隆抗體，則為提高抗體治療效果帶來了很大希望。

       此外，作者回顧了基于mRNA的藥物應用，重點是預防和治療傳染病和癌癥的疫苗的臨床試驗(圖8)。其中抗傳染病的mRNA疫苗中最經(jīng)典的例子是SARS-CoV-2 mRNA疫苗:2019年SARS-CoV-2出現(xiàn)，并在全球范圍內(nèi)引發(fā)大流行，首 個COVID-19疫苗被FDA批準緊急使用授權(quán)（圖9）。

       除此，也包括流感病毒mRNA疫苗、HIV mRNA疫苗、呼吸道合胞體病毒（RSV）mRNA疫苗、單純性皰疹病毒(HSV) mRNA疫苗、水痘帶狀皰疹病毒(VZV) mRNA疫苗、人巨細胞病毒(HCMV)mRNA疫苗、狂犬病毒mRNA疫苗、登革病毒mRNA疫苗。而癌癥疫苗則包括;黑色素瘤疫苗、惡性膠質(zhì)瘤疫苗、急性髓性白血病疫苗、腎細胞癌疫苗等。

       3 mRNA癌癥疫苗的耐受性及安全性 

       研究發(fā)現(xiàn)新表位可以繞過具有高免疫原性的中心耐受性，因為它們從不出現(xiàn)在正常組織中，并在癌細胞中產(chǎn)生基因突變的積累。因此，新表位被用于克服癌癥疫苗的中心耐受性和解決腫瘤異質(zhì)性的問題。而且mRNA疫苗也具有足夠的安全性，其不良事件一般為輕至中度，包括注射部位反應，如疼痛、腫脹、紅斑和流感樣疾病，如疲勞、肌痛、發(fā)熱和寒戰(zhàn)。

       4 mRNA疫苗佐劑

       佐劑對于基于mRNA的治療至關(guān)重要，尤其是mRNA疫苗，它可以放大和直接免疫應答。FDA批準了幾種用于人體的佐劑，包括鋁鹽、MF59、AS01、AS03、AS04等。

       5 基于mRNA的蛋白質(zhì)替代療法

       蛋白質(zhì)替代處理在用有利蛋白替代缺失或缺陷蛋白方面有著廣泛的應用?；趍RNA的治療方法已成為蛋白質(zhì)替代治療的新支柱，在多個領(lǐng)域得到了廣泛的探索，包括心臟病、肺部疾病、血液系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、癌癥、骨科疾病、神經(jīng)源性疾病、肌肉萎縮等。

       6 mRNA編碼肽及蛋白質(zhì)

       mRNA編碼的肽和蛋白的功能是選擇靶向細胞治療藥物的關(guān)鍵因素，直接影響mRNA的治療設計。對于需要翻譯后修飾以組裝成功能類型多肽的細胞，需要使用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)化酶或內(nèi)蛋白酶來精確傳遞。而蛋白質(zhì)則需要分泌到細胞外才能發(fā)揮其功能。因此，mRNA需要被傳遞到具有自然分泌功能的細胞中，否則需要將相應信號肽mRNA序列插入到分泌蛋白的ORF附近。

       7 基于mRNA的基因編輯療法及CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)

       mRNA被廣泛用于傳遞可編程核酸酶。mRNA具有瞬時表達、無突變風險的特點，是基因編輯治療中極具吸引力的方法，目前，多個基于mRNA基因編輯的臨床試驗正在進行中。此外，人工核酸內(nèi)切酶的發(fā)展帶動了基于mRNA的基因編輯技術(shù)的高速發(fā)展。mRNA藥物通過編碼人工核酸內(nèi)切酶，如ZFNs、TALENs和最近的CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細胞基因組信息。

       8 基于mRNA的治療

       在文章最后作者對基于mRNA的治療進行了介紹，主要包括基于mRNA的T淋巴細胞治療、基于mRNA的自體T細胞治療、基于mRNA的CD4+ T細胞治療、基于mRNA的干細胞治療、基于mRNA的多能干細胞(iPS)治療及基于mRNA藥物的聯(lián)合治療。

小結(jié)

       到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章對基于mRNA的治療工具進行了全面的介紹，從mRNA的結(jié)構(gòu)、制造、傳遞到應用，全文參考文獻近600篇，內(nèi)容非常豐富。

       目前mRNA治療正在快速崛起，是一個非常有前景的研究領(lǐng)域，由于其在靈活性、成本和開發(fā)速度方面的優(yōu)勢，該技術(shù)為傳染病和個性化藥物提供了巨大的好處和潛力。當然，要充分發(fā)揮這項技術(shù)的潛力，仍然需要克服包括缺乏擴大mRNA過程的經(jīng)驗和知識及靶向遞送技術(shù)等挑戰(zhàn)。