核酸藥物分類

       核酸藥物主要分為小核酸藥物和mRNA兩大類，小核酸藥物，即寡核苷酸藥物，包括反義核酸(ASO)、小干擾核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酸適配體(Aptamer)及其他。mRNA產(chǎn)品可分為mRNA疫苗和mRNA藥物。

       核酸藥物特點(diǎn)

       核酸藥物擁有明顯優(yōu)勢。傳統(tǒng)的小分子化藥和抗體藥物多是通過與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，但兩者的研發(fā)受到靶點(diǎn)蛋白可成藥性的限制，而核酸類藥物是通過與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，對細(xì)胞內(nèi)外和細(xì)胞膜蛋白均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而且多數(shù)核酸類藥物的作用基礎(chǔ)是堿基互補(bǔ)配對原則，只需知道靶基因的堿基序列，核酸藥物的序列設(shè)計就較為容易。

       然而，其不穩(wěn)定性、免疫原性、細(xì)胞攝取效率低、內(nèi)吞體逃逸難等缺陷限制了核酸藥物的發(fā)展，為了解決核酸藥物分子本身相關(guān)的挑戰(zhàn)，開發(fā)能夠促進(jìn)核酸吸收到靶細(xì)胞的遞送載體系統(tǒng)成為關(guān)鍵。這些遞送載體需要克服細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的屏障，耐受血液中的核酸酶活性，增強(qiáng)和協(xié)助核酸藥物細(xì)胞攝取，并在進(jìn)入細(xì)胞后促進(jìn)核酸藥物內(nèi)體逃逸。

       核酸藥物遞送系統(tǒng)

       早期研究多使用病毒作為遞送核酸的載體，臨床實(shí)驗(yàn)使用的病毒載體包括：腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒(LV)、單純皰疹病毒(HSV)等。然而，一些病毒載體的不良特性，包括潛在的致癌性、高免疫原性等會導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床不良事件，影響了對病毒載體臨床應(yīng)用的研究。隨著材料和制備技術(shù)的發(fā)展，價格低廉、易合成、易純化、具有高轉(zhuǎn)染效率和低免疫原性的非病毒載體成為遞送核酸藥物的“最 佳候選人”。

       GalNac偶聯(lián)修飾

       GalNac(N-乙?；陌肴樘前?偶聯(lián)修飾，是當(dāng)前最常用的核酸藥物遞送系統(tǒng)， GalNac是一種乳糖類似物通過將GalNac以三價態(tài)的方式共價偶聯(lián)至核酸3‘末端構(gòu)成。

       GalNac-siRNA偶聯(lián)化合物經(jīng)皮下注射后，能夠迅速通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝 臟，之后經(jīng)ASPGR受體介導(dǎo)快速被肝 臟細(xì)胞內(nèi)吞，并在溶酶體中積聚、緩慢釋放，持久不斷地裝載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)上，從而實(shí)現(xiàn)長效抑制作用。

       目前，GalNAc修飾的藥物主要有GalNAc-反義核酸(ASO)與GalNAc-siRNA，由于治療上有效的ASO已經(jīng)是經(jīng)過大量修飾的，因此遞送載體并不是必須的。而siRNA因?yàn)槠浔旧砣菀捉到?，所以多采用載體遞送技術(shù)。目前，利用GalNac技術(shù)上市及進(jìn)入臨床階段的藥物可見表1。

       表1. GalNac技術(shù)上市及進(jìn)入臨床的藥物

       納米顆粒

       1

       脂質(zhì)納米顆粒

       脂質(zhì)納米顆粒(Lipid Nanoparticle，LNP)，是脂質(zhì)載體給藥系統(tǒng)中的重要技術(shù)之一。

       主要成分分為以下四種：

         •  可電離的陽離子磷脂為最關(guān)鍵的輔料，是遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素，由于其比較容易被抗原呈遞細(xì)胞吸收，因此常應(yīng)用于疫苗；

         •  中性輔助磷脂，一般為飽和磷脂，可提高陽離子脂質(zhì)體的相變溫度，支持層狀脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的形成并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)排列；

         •  膽固醇，有較強(qiáng)的膜融合性，促進(jìn)mRNA胞內(nèi)攝入和胞質(zhì)進(jìn)入；

         •  聚乙二醇修飾的磷脂(PEGylated lipid)，位于脂質(zhì)納米粒表面，改善其親水性，避免被免疫系統(tǒng)快速清除，防止顆粒聚集，增加穩(wěn)定性。

       目前利用LNP技術(shù)已有三款上市藥物及十幾款臨床期的藥物，下表列舉了一些代表性的藥物。

       表2. 利用LNP技術(shù)上市及臨床的代表藥物

       2

       聚合物納米粒

       陽離子聚合物因其易于合成和靈活的特性，成為非病毒基因遞送載體的另一個主要類型。聚合物可以與核酸結(jié)合，在生理pH下形成多聚復(fù)合物，以促進(jìn)基因遞送。通常情況下，聚合物納米顆粒具有帶正電的單元，可促進(jìn)與核酸的靜電結(jié)合。此外，通過使用可降解的連接物，也可實(shí)現(xiàn)核酸與聚合物的共價連接。常見的聚合物材料包括聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖(CS)。

       另一類遞送RNA的聚合物，稱為樹枝狀大分子(dendrimers)。這些大分子以一個核心分子為中心，通過重復(fù)增長反應(yīng)合成具有高度分支的聚合物。攜帶陽離子基團(tuán)的樹枝狀大分子，可以與RNA生成復(fù)合物。已有研究顯示，它們可以將RNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，將siRNA遞送到肝 臟內(nèi)皮細(xì)胞中。改造樹枝狀大分子的結(jié)構(gòu)，可以保護(hù)核苷酸不被酶降解。

       siG12D-LODER是一種可生物降解的聚合物基質(zhì)，含有針對KRASG12D的siRNA。目前，諾華正在針對siG12D-LODER進(jìn)行二期臨床研究，以測試siG12D-LODER與化療藥物(如吉西他濱和紫杉醇)聯(lián)合治療局部晚期胰 腺癌患者的療效。

       3

       無機(jī)納米粒

       1、金納米顆粒

       金納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)特性、合成簡單和表面功能化的特性，可通過共價或非共價綴合與核酸選擇性協(xié)同修飾。核酸鏈通過硫醇基團(tuán)共價連接到金納米顆粒核心上(通常為13-15 nm)。這一策略可用于DNA和siRNA，它們可以直接連接到金核或聚合物修飾的金核上。

       球形核酸(SNA)是由排列在小球形金納米顆粒表面的核酸組成。目前該平臺藥物NU-0129正在進(jìn)行一項(xiàng)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤的臨床1期的研究。NU-0129穿過血腦屏障一旦進(jìn)入腫瘤，核酸成分就能夠靶向一種名為Bcl2L12的基因。研究人員認(rèn)為，用NU-0129靶向Bcl2L12基因，將有助于阻止膠質(zhì)瘤的生長。

       2、二氧化硅納米顆粒

       二氧化硅納米顆粒(直徑100-250nm)，由于其良好的生物相容性和可調(diào)性而被用于核酸遞送。通常，核酸分子通過弱的非共價相互作用，被裝載到二氧化硅納米顆粒中。小孔(2.5-5 nm)的二氧化硅納米顆粒適合于傳遞小的siRNA。

       3、氧化鐵納米顆粒

       氧化鐵納米顆粒(由Fe3O4或Fe2O3組成)具有一定尺寸的超順磁性，作為輸送載體和基于磁熱的療法顯示出了成功的效果。陽離子氧化鐵納米顆粒與陰離子核酸藥物，通過靜電相互結(jié)合。50-100nm的脂類包裹的氧化鐵納米顆粒，顯示出最 佳的siRNA遞送活性。

       新型遞送系統(tǒng)

       1

       外泌體

       外泌體是內(nèi)涵體來源，經(jīng)由多泡體與質(zhì)膜融合以后釋放到細(xì)胞外的，直徑介于50-150nm之間的膜性囊泡狀小體。外泌體內(nèi)部含有多種生物學(xué)大分子，包括蛋白質(zhì)、核酸和磷脂等。

       外泌體可在細(xì)胞間傳輸各種各樣的生物大分子，因此作為一種藥物遞送方式，具有顯著的先天優(yōu)勢：

       首先，外泌體是“天然馴化”的納米載體，本身內(nèi)含多種有效成分，因此可以適用的負(fù)載藥物成分類型非常豐富，包括小分子、核酸和重組蛋白等；

       其次，外泌體是內(nèi)源性的納米顆粒，免疫源性較低，因此安全性高；

       第三，外泌體可以循環(huán)至人體所有的腔室，具有比較好的組織選擇性；

       最后，可以對外泌體進(jìn)行復(fù)雜的工程化改造，通過基因或者化學(xué)等方式，對外泌體的成分以及生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控，從而能夠更好地服務(wù)于我們的治療目的。

       表3. 外泌體遞送核酸藥物研究情況

       2

       多肽類

       目前已上市的核酸藥物遞送采用的技術(shù)，無法解決特定組織的靶向性問題，多肽可以解決許多其它遞送系統(tǒng)無法解決的問題。非天然氨基酸的化學(xué)修飾，極大地提高了多肽藥物在體內(nèi)的半衰期，環(huán)肽技術(shù)發(fā)展增加了多肽結(jié)構(gòu)的剛性、環(huán)肽與靶蛋白接觸面積大增強(qiáng)其親和力，PDC藥物具有強(qiáng)力的腫瘤穿透性、無免疫原性、腎代謝等特點(diǎn)。

       目前，Ionis、Alnylam 、Entrada Therapeutics等公司紛紛建立多肽核酸偶聯(lián)藥物平臺，多肽核酸偶聯(lián)物未來可期。

       3

       其他

       科學(xué)大牛張鋒創(chuàng)立的Aera Therapeutics推出了一種名為蛋白納米顆粒(Protein Nanoparticles，PNP)的新型遞送平臺，利用內(nèi)源性人類蛋白質(zhì)，解決當(dāng)前遞送技術(shù)的局限。

       專注于RNA療法的生物技術(shù)公司Altamira Therapeutics宣布，其正在研發(fā)一種新穎的基于肽的SemaPhore納米顆粒技術(shù)平臺。該遞送平臺被設(shè)計用于通過全身或局部給藥，可安全有效地將寡核苷酸如siRNA以及mRNA遞送到靶細(xì)胞中。目前，該公司基于此平臺已建立了2條在研siRNA項(xiàng)目臨床前管線，用于治療KRAS驅(qū)動癌癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

       小結(jié)

       核酸療法的研發(fā)經(jīng)歷了漫長的發(fā)展歷程，化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)等關(guān)鍵技術(shù)的突破在核酸療法的產(chǎn)業(yè)化中發(fā)揮了重要的作用。

       通過選擇較好的藥物遞送載體以及采用靶向修飾等策略，超級藥物核酸療法將引領(lǐng)創(chuàng)新藥進(jìn)入新時代。

       參考文獻(xiàn)：

       1.Kulkarni, J.A. et al. “The Current Landscape of Nucleic Acid Therapeutics.” Nature Nanotechnology, 2021,16(841):630-643.

       2.DebackerAJ, Voutila J, Catley M, Blakey D,Habib N. Delivery of Oligonucleotides to the Liver with GalNAc: From Researchto Registered Therapeutic Drug. Mol Ther. 2020 Aug 5;28(8):1759-1771.

       3.https://clinicaltrials.gov/