近日，上海細(xì)胞治療集團(tuán)與中國科學(xué)院南海海洋研究所研究員王曉雪團(tuán)隊(duì)合作，共同在微生物工程應(yīng)用類經(jīng)典期刊Metabolic Engineering上（IF=8.4），發(fā)表了毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)應(yīng)用方面的最新成果“Minimized antibiotic-free plasmid vector for gene therapy utilizing a new toxin-antitoxin system” (DOI: 10.1016/j.ymben.2023.07.003)。研究以細(xì)胞/基因治療臨床需求為導(dǎo)向，開發(fā)了一種利用毒素-抗毒素系統(tǒng)作為克隆篩選標(biāo)記的小骨架質(zhì)粒載體并命名為太質(zhì)粒（Tiniplasmid）。
以質(zhì)粒為載體的細(xì)胞基因治療產(chǎn)品與以病毒為載體的產(chǎn)品相比，在安全性、規(guī)?；糯?、低成本等多方面更具潛力。但質(zhì)粒骨架的大小對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率以及細(xì)胞毒 性有很大的影響，縮小質(zhì)粒骨架對于提升轉(zhuǎn)基因效率、降低細(xì)胞毒 性具有重要意義。綜合毒素殺菌能力以及抗毒素大小的優(yōu)勢，選取了珊瑚共生菌來源的TA系統(tǒng)Rs_0636/Rs_0637作為目標(biāo)TA系統(tǒng)，成功研發(fā)了最小骨架小于500bp的無抗太質(zhì)粒系統(tǒng)，比1500bp的常規(guī)pUC57質(zhì)粒骨架小1000bp以上。
圖.利用毒素-抗毒素系統(tǒng)Rs_0636/ Rs_0637作為篩選標(biāo)記在真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的應(yīng)用
與此同時(shí)，作為載體的常規(guī)質(zhì)粒通常采用抗生素抗性基因作為最重要的篩選標(biāo)記用于DNA克隆、質(zhì)粒發(fā)酵等環(huán)節(jié)，但由于抗生素使用引發(fā)的安全性問題，抗性基因在食品與藥品等領(lǐng)域的使用受到嚴(yán)格限制，尤其是在基因治療和DNA疫苗研發(fā)方面。鑒于上述原因，研發(fā)高效且安全的新型篩選系統(tǒng)來取代抗生素抗性基因的使用在臨床研究中顯得尤為重要。TA系統(tǒng)由具有明顯細(xì)菌毒 性的毒素以及能夠拮抗其毒 性的抗毒素編碼組成，具有開發(fā)成新型篩選系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。
研究中，王曉雪團(tuán)隊(duì)將攜帶誘導(dǎo)型啟動子的毒素基因整合到工程菌的基因組上，通過誘導(dǎo)毒素來篩選和生產(chǎn)攜帶抗毒素的重組太質(zhì)粒。通過測定不同家族毒素的殺菌活性來評估其作為篩選標(biāo)記的潛力。研究發(fā)現(xiàn)ParE家族毒素具有明顯的殺菌活性，且其對應(yīng)的抗毒素能夠通過直接的蛋白-蛋白相互作用來拮抗其細(xì)胞毒 性，該TA系統(tǒng)與抗生素系統(tǒng)具有相當(dāng)?shù)目寺『Y選效率以及DNA質(zhì)粒得率。
在上海細(xì)胞治療集團(tuán)開展的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，與目前商業(yè)化的載體相比，基于該系統(tǒng)開發(fā)的太質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率方面更具優(yōu)勢，系統(tǒng)安全性評估數(shù)據(jù)也表明該系統(tǒng)在基因治療和DNA疫苗的研發(fā)中具有非常好的應(yīng)用潛力。
南海海洋研究所博士研究生陳喆為論文的第一作者，副研究員姚建云為論文的共同第一以及共同通訊作者，研究員王曉雪為論文的主要通訊作者。以上研究工作得到了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、上海市浦江計(jì)劃、科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等的資助。
上海細(xì)胞治療集團(tuán)就該技術(shù)進(jìn)行了專利申請，具有完全的自主知識產(chǎn)權(quán)。張平靜為專利第一發(fā)明人、劉韜、孫艷、錢其軍為共同作者和發(fā)明人。
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