任哲郯¹，謝雨瑤¹，劉安琪^2*

       心血管疾病 (Cardiovascular Disease，CVD) 是迄今為止世界上的主要死因，每年造成1770萬人死亡[1]。而我國心力衰竭發(fā)生率居高不下：25歲以上患病率1.1%，總數(shù)超過1200萬，主要病因為高血壓及冠心病[2]。因此心血管疾病的防控仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。一系列損害心室血液充盈或流出的結構或功能障礙可導致心力衰竭 (heart failure, HF)[3]。心力衰竭作為具有多種病因及各種因素影響的臨床綜合征，由于缺乏對發(fā)病率、普遍性和預后的可靠的基于人群的估計，一直沒有辦法做到準確評估HF的程度 [4、5]。斑馬魚胚胎期的心臟發(fā)育很迅速，心臟功能容易觀察和量化。對于反向遺傳學，通過使用嗎啉反義寡核苷酸和CRISPR-Cas9來調控基因功能，使斑馬魚成為體內選擇基因的主要動物模型之一[6]。斑馬魚有很強的心臟再生能力，它們的心肌細胞能夠通過恢復到不成熟狀態(tài)，然后增殖并替換受損的心臟組織[7]。然而，利用斑馬魚模型來增加對心力衰竭和心臟重塑（包括心臟肥大和增生）的了解，卻沒有得到應有的重視。本文將會系統(tǒng)回顧藥物誘導斑馬魚心血管疾病模型的方法，并對其優(yōu)缺點進行對比，以期為斑馬魚模型在研究人類心血管疾病機制和治療中提供新思路。

       1 斑馬魚作為人類疾病動物模型的優(yōu)缺點

       在過去的研究中，斑馬魚已經成為研究心臟疾病的一個強大的脊椎動物模型。越來越多地被用來研究發(fā)育、解剖和生理學，通過遺傳學、藥理學和其他醫(yī)學實驗技術[7]，構建斑馬魚模型的優(yōu)勢越來越明顯（表1）。斑馬魚作為心血管系統(tǒng)疾病的常用模型，也具有許多優(yōu)點和缺點（表2），即便如此，斑馬魚的心肌細胞再生能力和電生理特點也使其成為在心肌損傷和心力衰竭治療的重要突破口。

表1 斑馬魚作為人類一般疾病模型的優(yōu)缺點

表2 斑馬魚作為人類心血管疾病模型的優(yōu)缺點

       2 藥物誘導的斑馬魚心力衰竭模型

       2.1 異丙腎上腺素

       已知β-腎上腺素能受體(β-AR)信號在人類HF中失調。在嚙齒類動物中，異丙腎上腺素 (isoproterenol, ISO, 又名喘息定) 的急性或慢性β-AR激活會導致心肌損傷,導致心臟功能障礙和心室重構，Grimm等[11]、Heather等[12]、Wang等[13]依據(jù)此建立了HF模型。在成年斑馬魚中，ISO連續(xù)給藥14天會引起類似于哺乳動物的嚴重收縮性心臟功能障礙，伴隨著β-AR成分的轉錄變化、ANP和BNP基因表達的增加、細胞死亡增加、炎癥加劇和心肌細胞對Ca2+處理受損等[14]。然而，與哺乳動物模型不同的是，斑馬魚模型沒有檢測到心肌細胞的纖維化。在胚胎斑馬魚中，ISO連續(xù)給藥5天誘導收縮性心臟功能障礙以及ANP和BNP基因表達的增加[14]。因此，給予胚胎和成年斑馬魚ISO刺激對于心臟肥大、心臟重塑和HF的病理生理機制的研究是可行的。

       2.2 去氧腎上腺素

       去氧腎上腺素(phenylephrine, PE, 又名新福林)是選擇性α1 -腎上腺素能受體激活劑。Iaccarino等[15]給予小鼠PE會增加血壓并通過增加心室后負荷導致心臟肥大。Romano等[16]用PE處理離體培養(yǎng)成年斑馬魚心臟會誘導其肥大。用鬼筆環(huán)肽染色的肌動蛋白和胚胎心外膜標記物WT1提示，經PE處理的離體成年斑馬魚心臟可誘導心肌細胞肥大和心外膜增生。這種離體培養(yǎng)成年斑馬魚心臟肥大模型類似于哺乳動物模型，因其實驗條件簡單，可能在某種程度上為研究心臟肥大提供優(yōu)勢。

       2.3 馬兜鈴酸

       馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA) 是一種常見于馬兜鈴科開花植物中的化學物質。AA是一種中草藥成分，已知對多種器官有毒 性[17]。 在胚胎斑馬魚中,給予AA會導致心臟肥大和心肌收縮力逐漸減弱。這種病理變化是對動物模型及人類有嚴重生命危險[18]。取經AA處理的胚胎斑馬魚樣本，進行石蠟包埋切片染色，電子顯微鏡鏡檢顯示心內膜丟失、心肌細胞肥大和心臟纖維紊亂[17]。該作者還展示了該模型在藥物發(fā)現(xiàn)方面的潛力，并確定了三種可減弱HF的化合物：絲裂原活化蛋白激酶1(MEK-1)、查耳酮衍生物C25和酚類化合物A11[19]。另一項使用相同AA誘導的HF模型的研究表明，使用恩格列凈（一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（SGLT2）抑制劑）,用于治療II型糖尿病和HF，減弱心臟形態(tài)變化，并降低ANP和BNP基因表達以及胚胎斑馬魚的死亡率[20]。

       2.4 多環(huán)芳烴

       污染導致的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAH)暴露與心臟病變有關，例如心臟肥大、心律失常和收縮功能障礙[21]。Hicken等[22]、Incardona等[23]在斑馬魚中，胚胎發(fā)育過程中接觸多環(huán)芳烴也具有心臟毒 性，并對心臟發(fā)育產生不利影響。高環(huán)多環(huán)芳烴、苯并(a)芘 (benzoapyrene, BaP) 在高濃度下會導致心動過緩和心包水腫[23]。Huang等[18]說明胚胎斑馬魚發(fā)育過程中暴露于低劑量BaP會導致成年斑馬魚心臟肥大，表現(xiàn)為心臟重量與體重比增加、心臟中膠原蛋白沉積以及ANP、BNP和原癌基因c-Myc的表達升高。同樣，胚胎斑馬魚短暫暴露于低濃度原油會影響后期的心臟功能[22]。

       2.5 鹽酸苯肼

       鹽酸苯肼(phenylhydrazine hydrochloride, PHZ)是一種小分子，Norman等[24]可通過裂解紅細胞引起貧血。Sun等[25]證明慢性貧血導致成年斑馬魚的肥大和增生導致心臟肥大。Ernens等[26]給予成年斑馬魚PHZ 5周后，短軸縮短率降低，心室直徑增加。然而，由于斑馬魚具有從HF中恢復的巨大能力，因此在停止給予PHZ 3周后，心臟功能恢復到給藥前水平。因此，該模型可用于研究心臟修復機制。

       2.6 維拉帕米

       維拉帕米（又名異搏定）是一種鈣通道阻滯劑，用于治療心律失常、高血壓和心絞痛。過量服用維拉帕米會導致人類HF。Zhu等[27]開發(fā)了一種用于藥物篩選的維拉帕米誘導的胚胎斑馬魚HF模型。給予維拉帕米可引起胚胎斑馬魚心包水腫和靜脈淤血，心輸出量和血流速度降低[27]。該模型通過測試8種人類HF藥物的療效進行驗證，這些藥物對斑馬魚HF模型均顯示出顯著的治療效果[27]。因此，這種胚胎斑馬魚HF模型可用于體內藥物篩選。

       2.7 托特羅定

       托特羅定是一種M毒蕈堿受體拮抗劑，Burczyk等[28]已確定其為斑馬魚胚胎心臟傳導的抑制劑。托特羅定治療會導致心率減慢、心包水腫和心律失常。此外，它還誘導Tbx18基因的表達，這對于心肌細胞分化為起搏細胞至關重要。用托特羅定靶向抑制M受體可能會在人類心臟中誘導新的起搏細胞并改善心律失常起到一定作用[28]。因此，該模型可用于研究心臟傳導系統(tǒng)。

       2.8 特非那定

       特非那定是一種常用的H1受體阻斷藥，用于治療過敏。然而，特非那定治療過敏是常常伴有發(fā)生心律失常的風險。Gu等[29]開發(fā)了特非那定誘導胚胎斑馬魚的擴張性心肌病DCM模型。給予特非那定后，胚胎斑馬魚表現(xiàn)出循環(huán)血量減少、心率和心肌收縮力降低、房室傳導阻滯、心包水腫和心室體積擴大[29]。此外，心肌細胞發(fā)生凋亡，BNP基因表達增加。這種快速而簡單的模型可用于非缺血性HF的藥物篩選和毒 性測定。

       2.9 蒽環(huán)類藥物

       蒽環(huán)類藥物是常用的抗癌藥物，具有嚴重的不良反應，這其中就包括嚴重的心臟毒 性。Han等[30]已經在胚胎斑馬魚中研究了蒽環(huán)類藥物對心臟發(fā)育的毒 性，其對心臟的影響與哺乳動物模型相似。阿霉素是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，Liu等[31]利用阿霉素誘導胚胎斑馬魚的CM心肌病模型概括了人類患者中觀察到的心肌細胞凋亡和收縮力下降。該模型可用于篩選心臟保護藥物和研究心臟保護機制。

       3 討論

       心功能不全分為兩種類型，其一是常見于冠心病和心肌病等引起的心臟 收縮力降低[射血分數(shù)降低的心力衰竭 (heart failure with a reduced ejection fraction, HFrEF)]，另一類是常見于高血壓伴左室肥厚和肥厚型心肌病等引起的心肌舒張功能異常[射血分數(shù)保留的心力衰竭 (heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF)][32]。根據(jù)流行病學調查，HFpEF正在成為HF的主要存在形式[33]。HFpEF的病因尚不完全清楚，并且缺少改善預后的藥物。因此，在構建HF動物模型時，盡可能準確地表述不同的心功能不全類型非常重要。目前，斑馬魚HF模型在收縮或舒張功能障礙方面在很大程度上仍然沒有主要特征。然而，隨著超聲動態(tài)心動圖的發(fā)展和可用性，成年斑馬魚HF亞型的特征變得越來越普遍[34-36]。而在成年斑馬魚超聲動態(tài)心動圖中，建立一套完整標準化成像條件（麻 醉、水溫等）指南和表征心臟功能的標準等對于HF亞型分型顯得尤為重要。另外，目前胚胎斑馬魚HF模型在說明HF亞型分型中也有一定進展[37]。

       隨著心臟負荷的逐漸增大，心臟重塑也在緩慢發(fā)展。成人心肌細胞是終末分化細胞，不能隨著壓力的增大而數(shù)量增加。相反，心肌細胞的體積會發(fā)生代償性增大（心臟肥大）來維持足夠的心臟功能滿足機體的需求。隨著時間的推移，這種適應性肥大變得不適應并通過許多分子信號通路發(fā)展為HF，這其中的機制在很大程度上仍然不清楚[38、39]。目前已知這些導致心臟重塑的機制包括細胞生長和增殖調控、基因表達、免疫反應、細胞代謝、線粒體功能、纖維化、細胞內鈣離子處理受損、細胞死亡等[40]。心臟肥大對機體是有益的還是有害的的問題目前仍不清楚[41]。與人類不同，斑馬魚的心臟能夠通過心肌細胞增殖和細胞大小的增大（肥大）來應對心臟負荷的增大。而且胚胎斑馬魚心臟中心肌細胞數(shù)量和大小的量化相對簡單。這使得斑馬魚成為研究代償性與失代償性心臟重塑具體機制的重要模型。

       4 結論

       本文系統(tǒng)回顧了藥物誘導斑馬魚心血管疾病模型的方法。這對于斑馬魚作為人源化動物模型具有十分重要的意義，斑馬魚模型目前已用于體內高通量藥物和藥物毒 性的篩選、藥物誘導的心臟毒 性研究，以及作為納米顆粒載體對于機體的毒 性[42、43]。并且，在心電圖中藥物對QT間期的影響也顯示出人和斑馬魚之間良好的相關性[44]。在胚胎斑馬魚HF模型中，用于治療HF的藥物已被證明可以預防急性HF[45]。另外，基于斑馬魚體積小、繁殖速度快等特點，一些物理構建模型的方法也有待探究。因此，相信在不久的未來，斑馬魚模型將會在各個領域為人類疾病的研究做出巨大貢獻。

       參考文獻（References）

       [1] Dokainish H, Teo K, Zhu J, et al. Global mortality variations in patients with heart failure: results from the International Congestive Heart Failure (INTER-CHF) prospective cohort study[J]. The Lancet Global Health, 2017.

       [2] 王華,李瑩瑩,柴坷,張嵬,李新立,董吁鋼,周京敏,霍勇,楊杰孚.中國住院心力衰竭患者流行病學及治療現(xiàn)狀[J].中華心血管病雜志,2019(11):865-874.

       [3] Yancy CW, Jessup M, Bozkurt B, et al. 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure[J]. Circulation, 2013, 128(16):1810-1852.

       [4] Briceno, Natalia, Perera, et al. To Revascularise or Not To Revascularise, That Is the Question: the Diagnostic and Management Conundrum of Ischaemic Cardiomyopathy[J]. Current cardiology reports, 2016.

       [5] G.E. Burch, T.D. Giles, H.L. Colcolough. Ischemic cardiomyopathy[J]. American Heart Journal, 1970.

       [6] Stainier D, Raz E, Lawson ND, et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish[J]. Plos Genetics, 2017, 13(10).

       [7] Gut P, Reischauer S, Stainier DYR, et al. LITTLE FISH, BIG DATA: ZEBRAFISH AS A MODEL FOR CARDIOVASCULAR AND METABOLIC DISEASE.[J]. Physiological Reviews, 2017, 97(3):889-938.

       [8] Barbazuk WB, Korf I, Kadavi C, et al. The Syntenic Relationship of the Zebrafish and Human Genomes[J]. Genome Research, 2000, 10(9):1351-1358.

       [9] R, Arnaout, T, et al. Zebrafish model for human long QT syndrome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007.

       [10] Howe DG, Bradford YM, Tom C, et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics[J]. Nucleic Acids Research, 2013(D1):854-60.

       [11] Daniela G, Dietmar E, Heribert S, et al. Development of heart failure following isoproterenol administration in the rat: role of the renin-angiotensin system[J]. Cardiovascular Research, 1998(1):1.

       [12] Heather LC, Catchpole AF, Stuckey DJ, et al. Isoproterenol induces in vivo functional and metabolic abnormalities: similar to those found in the infarcted rat heart.[J]. Journal of Physiology & Pharmacology, 2009, 60(3):31-39.

       [13] Wang J, Huertas-Vazquez A, Wang Y, et al. Isoproterenol-Induced Cardiac Diastolic Dysfunction in Mice: A Systems Genetics Analysis[J]. Frontiers in Cardiovascular Medicine, 2019, 6.

       [14] Kossack M, Hein S, Juergensen L, et al. Induction of cardiac dysfunction in developing and adult zebrafish by chronic isoproterenol stimulation[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2017, 108:95-105.

       [15] Iaccarino G, Keys JR, Rapacciuolo A, et al. Regulation of myocardial betaARK1 expression in catecholamine-induced cardiac hypertrophy in transgenic mice overexpressing alpha1B-adrenergic receptors.[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2001, 38(2):534-540.

       [16] Romano N, Ceci M. Are microRNAs responsible for cardiac hypertrophy in fish and mammals? What we can learn in the activation process in a zebrafish ex vivo model[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 2020, 1866(11):165896.

       [17] Huang CC, Chen PC, Huang CW, et al. Aristolochic Acid Induces Heart Failure in Zebrafish Embryos That is Mediated by Inflammation[J]. Toxicological Sciences, 2007, 100(2):486.

       [18] Huang L, Gao D, Zhang Y, et al. Exposure to low dose benzo[a]pyrene during early life stages causes symptoms similar to cardiac hypertrophy in adult zebrafish[J]. Journal of Hazardous Materials, 2014, 276(9):377-382.

       [19] Huang CC, Monte A, Cook JM, et al. Zebrafish heart failure models for the evaluation of chemical probes and drugs[J]. Assay and drug development technologies, 11(9-10), 561–572.

       [20] Shi X, Verma S, Yun J, et al. Effect of empagliflozin on cardiac biomarkers in a zebrafish model of heart failure: clues to the EMPA-REG OUTCOME trial?[J]. Molecular & Cellular Biochemistry, 2017.

       [21] Marris CR, Kompella SN, Miller MR, et al. Polyaromatic hydrocarbons in pollution: a heart‐breaking matter[J]. Wiley-Blackwell Online Open, 598(2).

       [22] Hicken CE, Linbo TL, Baldwin DH, et al. Sublethal exposure to crude oil during embryonic development alters cardiac morphology and reduces aerobic capacity in adult fish.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(17):7086-90.

       [23] Incardona JP, Linbo TL, Scholz NL. Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2011, 257(2):242-249.

       [24] Norman TD, Mcbroom RD. Cardiac Hypertrophy in Rats with Phenylhydrazine Anemia[J]. Circulation Research, 1958, 6(6):765-770.

       [25] Sun X, Hoage T, Bai P, et al. Cardiac Hypertrophy Involves Both Myocyte Hypertrophy and Hyperplasia in Anemic Zebrafish[J]. Plos One, 2009, 4(8):e6596.

       [26] Isabelle E, Lumley AI, Yvan D. Restoration of cardiac function after anaemia-induced heart failure in zebrafish[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2018, 121:223-232.

       [27] Zhu XY, Wu SQ, Guo SY, et al. A Zebrafish Heart Failure Model for Assessing Therapeutic Agents[J]. Zebrafish, 2018:zeb.2017.1546.

       [28] Burczyk MS, Burkhalter MD, Tena TC, et al. Muscarinic receptors promote pacemaker fate at the expense of secondary conduction system tissue in zebrafish[J]. JCI Insight, 2019, 4(20).

       [29] Gu G, Na Y, Hyewon C, et al. Zebrafish Larvae Model of Dilated Cardiomyopathy Induced by Terfenadine[J]. Korean Circulation Journal, 2017, 47(6):960-969.

       [30] Han Y, Zhang JP, Qian JQ, et al. Cardiotoxicity evaluation of anthracyclines in zebrafish (Danio rerio)[J]. Journal of Applied Toxicology Jat, 2015, 35(3):241-252.

       [31] Liu Y, Asnani A, Zou L, et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase[J]. Science Translational Medicine, 2014, 6(266):266ra170.

       [32] Ponikowski P, Voors AA, Anker SD, et al. 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure[J]. European Journal of Heart Failure, 2016, 18(8):2129.

       [33] Dunlay SM, Roger VL, Redfield MM, et al. Epidemiology of heart failure with preserved ejection fraction[J]. Nature Reviews Cardiology, 2017, 14(10).

       [34] Lee J, Cao H, Kang BJ, et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 2014;11(5):447-454. doi:10.1089/zeb.2014.1016.

       [35] Ernens I, Lumley AI, Devaux Y, et al. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish[J]. Zebrafish, 2016:zeb.2016.1274.

       [36] Wang LW, Huttner IG, Santiago CF, et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models[J]. Disease Models & Mechanisms, 2016, 10(1):63-76.

       [37] Chen YH, Pai CW, Huang SW, et al. Inactivation of Myosin Binding Protein C Homolog in Zebrafish as a Model for Human Cardiac Hypertrophy and Diastolic Dysfunction[J]. Journal of the American Heart Association, 2013, 2(5):e000231-e000231.

       [38] Mcmullen JR, Jennings GL. Differences between pathological and physiological cardiac hypertrophy: novel therapeutic strategies to treat heart failure.[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 34(4):255-262.

       [39] Tham YK, Bernardo BC, Ooi J, et al. Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure: signaling pathways and novel therapeutic targets[J]. Archives of Toxicology, 2015.

       [40] Lou Q, Janardhan A, Efimov I R.Remodeling of calcium handling in human heart failure.[J]. Springer Netherlands, 2012.

       [41] Carabello BA. Is Cardiac Hypertrophy Good or Bad?: The Answer, Of Course, Is Yes[J]. JACC: Cardiovascular Imaging, 2014.

       [42] Ke?ler M, Rottbauer W, Just S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery[J]. Expert Opin Drug Discov. 2015;10(11):1231-41.

       [43] Zakaria ZZ, Benslimane FM, Nasrallah GK, et al. Using Zebrafish for Investigating the Molecular Mechanisms of Drug-Induced Cardiotoxicity[J]. BioMed Research International, 2018, 2018:1-10.

       [44] Milan DJ, Jones IL, Ellinor PT, et al. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation[J]. American Journal of Physiology, 2006, 291(1):269-273.

       [45] Zhu XY, Wu SQ, Guo SY, et al. A Zebrafish Heart Failure Model for Assessing Therapeutic Agents[J]. Zebrafish, 2018:zeb.2017.1546.

       作者簡介：@任哲郯，男，中共預備黨員，錦州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院2019級臨床醫(yī)學專業(yè)8班班長。參與省部級科研項目7項，發(fā)表學術論文6篇。立志為祖國醫(yī)學事業(yè)貢獻青春力量。