導(dǎo)語

       目前，各種測序技術(shù)已經(jīng)成為了藥物研發(fā)過程中的得力工具。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），簡單從字面理解，就是一種在單細胞水平上對轉(zhuǎn)錄組進行測序分析的技術(shù)。目前，這項技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用，并在應(yīng)用中不斷地快速發(fā)展，成為我們研究細胞類別、疾病發(fā)生過程等問題的有力工具。

       PART. 01

       為什么要用scRNA-seq？

       傳統(tǒng)的批量測序（bulk RNA sequencing）有一個繞不過的難題：細胞的異質(zhì)性。

       眾所周知，對于多細胞生物來說，盡管由同一個受精卵發(fā)育而來，但不同細胞之間的基因表達必然是有差異的，這些差異導(dǎo)致了細胞的分化，使不同的細胞承擔(dān)不同的生理功能。粗糙地看，不同器官、組織的細胞組成不同，但使分析變得棘手的問題在于，即使是在形態(tài)上無法區(qū)分的細胞之間基因表達水平和對刺激的反應(yīng)方面也存在很大的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在組織生物學(xué)和疾病的發(fā)展中起著重要作用，例如病原體細胞或癌細胞之間的表達異質(zhì)性可能與人類疾病有關(guān)，在進行藥物研發(fā)時，細胞的異質(zhì)性也往往造成靶點難尋、耐藥性等問題。

       圖1. 腫瘤異質(zhì)性(Nature 2013 Vol. 501 Issue 7467 Pages 338-345)

       在使用多細胞水平的分析時，每個細胞的異質(zhì)信息很容易被掩蓋在多個細胞的平均信息中。比如大家非常熟悉的Western blot。當我們使用Western blot檢測蛋白質(zhì)的含量時，我們無法區(qū)分目標蛋白是在10%的細胞中強表達，還是在50%的細胞里中等表達，還是在所有細胞中弱表達。但如果使用流式細胞術(shù)，我們就可以清晰地區(qū)分上述情況。

       圖2. Western blot VS 流式細胞術(shù)(https://zhuanlan.zhihu.com/p/28844468)

       單細胞轉(zhuǎn)錄組測序也是一樣的道理。當使用bulk RNA-seq時，每個細胞的轉(zhuǎn)錄組差異同樣會被多個細胞的平均信息所掩蓋，而如果在單細胞水平對每個細胞進行分析，我們就可以得到異質(zhì)性信息，進而可以對細胞進行更準確地分群、發(fā)現(xiàn)新的細胞種類、研究隨機基因的表達，以及對細胞譜系路徑進行探索。為藥物研發(fā)提供更準確的信息，開辟新的路徑，實現(xiàn)真正的“對癥下藥”。

       圖3. 單細胞測量保存了大量基因組分析丟失的關(guān)鍵信息(Genome Research 2015 Vol. 25 Issue 10 Pages 1491-1498)

       自從2009年由湯富酬等人開發(fā)出第一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，到今天已經(jīng)有幾十種不同的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被開發(fā)出來，它們各自有不同的優(yōu)勢與缺點，我們可以在了解不同技術(shù)的優(yōu)缺點之后，選擇最適合自己的研究的技術(shù)。

       圖4. scRNA-seq發(fā)展史

       圖5. 部分常用的scRNA-seq(Chen, G., et al. (2019). "Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis." Frontiers in Genetics 10(317).)

       PART. 02

       單細胞RNA測序技術(shù)原理

       單細胞測序基本流程通常分為以下幾個部分：單細胞分離、基因擴增、構(gòu)建信息庫、高通量測序、數(shù)據(jù)分析。單細胞分離技術(shù)分類眾多，單細胞分離溶解后獲得pg級的核酸，通過擴增至ng或μg級，然后用于后續(xù)的測序。目前常用單細胞分離方法有有限稀釋法、顯微操作（手工細胞采集）、激光捕獲顯微切割、熒光活化細胞分選、磁活化細胞分選、微流體技術(shù)等。

       圖6. 單細胞測序流程 (李勃,朵泓睿.單細胞RNA測序數(shù)據(jù)分析方法研究進展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       目前單細胞RNA測序常用技術(shù)有Tang RNA-seq、Smart-seq、Smart-seq 2、CEL-seq、Quartz-seq、STRT-seq、Drop-seq等，而利用這些技術(shù)構(gòu)建的被大規(guī)模使用的測序平臺有10xGenomics平臺、Illumina®Bio-Rad® 平臺、BD Rhapsody™ 平臺、ICELL8 平臺和C1™ 單細胞全自動制備系統(tǒng)等等。接下來以10xGenomics平臺為代表具體介紹單細胞RNA測序過程中基因擴增與信息庫構(gòu)建的具體過程。

       10xGenomics

       10×Genomics平臺基于微滴的核酸條形碼分配系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供了數(shù)以百萬計級的攜帶唯一DNA條形碼的微滴，通過微流控技術(shù)，首先將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴（GEMs）中。凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測序的帶條形碼和UMI信息的cDNA。液滴油層破碎，cDNA擴增，制備cDNA文庫，然后使用Illumina測序平臺對文庫進行測序檢測，即可獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數(shù)據(jù)。

       圖7. 10xGenomics平臺流程圖 (https://zhuanlan.zhihu.com/p/269461589)

       10xGenomics技術(shù)的核心是油滴包裹的凝膠珠（GEMs）。GEM（10X Genomics Gel in Emulsion）是一個由 mRNA、磁珠、乳液組成的液滴狀反應(yīng)系統(tǒng)，后續(xù)的細胞分選、反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)都是在這個液滴反應(yīng)系統(tǒng)中進行。GEMs 的結(jié)構(gòu)確保了＞90% 的油滴內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物都可以順利用唯一的 barcode 分子標記。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成。Gel bead上連接的引物序列包含四個部分：Illumina TruSeq Read 1測序引物、16 nt的條形碼（Barcode）、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反轉(zhuǎn)錄引物

       圖8. GEM示意圖（左），Gel bead示意圖（右）

       具體流程是先將樣本制備成單細胞懸浮液，細胞質(zhì)檢然后進行細胞計數(shù)和細胞活性測定，最終使細胞活性高于90%，細胞濃度為700～1200個細胞/μL。

       取75μL Master Mix＋細胞懸浮液、40μL的含有barcode信息的凝膠珠和280μL的油滴分別加入到Chromium Chip B的不同小室，經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成油滴包裹的凝膠珠（Gel Bead-In- EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝膠珠、單細胞、Master Mix和油。

       收集GEMs，并將其全部混合，凝膠珠在每個油滴內(nèi)自動溶解釋放大量Barcode引物序列，細胞裂解釋放mRNA，mRNA與逆轉(zhuǎn)錄酶、凝膠珠上的poly dT反轉(zhuǎn)錄引物以及dNTP底物相接觸，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生用于測序的帶有Barcode和UMI信息的cDNA一鏈，再以SMART擴增方法完成第二鏈合成。

       cNDA片段化油滴破碎，磁珠純化cDNA一鏈，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。

       cDNA擴增完成后，首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200- 300bp左右的片段，通過末端修復(fù)、加A進行cDNA片段篩選，P7 adaptor接頭連接Read2測序引物，并通過PCR擴引入樣品Index，最后進行片段篩選，從而構(gòu)建含有P5和P7接頭的cDNA文庫。

       文庫完成以后，進行庫檢，cDNA文庫庫檢合格后，直接在Illumina的測序儀上進行測序。測序完成之后，進行數(shù)據(jù)分析。

       數(shù)據(jù)分析

       單細胞RNA測序得到的數(shù)據(jù)通常從這幾個方面展開進行：1、序列比對和表達水平量化；2、數(shù)據(jù)預(yù)處理；3、數(shù)據(jù)標準化；4、高變異基因的選擇和降維分析；5、聚類分析；6、細胞類型注釋；7、差異表達的鑒定及富集分析；8、進階分析：如細胞譜系追蹤、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、空間轉(zhuǎn)錄組等。

       圖9. scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析(李勃,朵泓睿.單細胞RNA測序數(shù)據(jù)分析方法研究進展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       PART. 03

       單細胞測序的優(yōu)缺點與

       現(xiàn)在一些主流技術(shù)之對比

       單細胞測序的第一個缺陷是樣本制備和建庫成本更高，數(shù)據(jù)量更大，更加復(fù)雜，需要更多時間、設(shè)備、容量來進行該項工作。

       單細胞測序第二個缺陷是跨細胞的生物學(xué)誤差，是因為樣品細胞之間存在一些生物學(xué)變異，主要包括：

       1、轉(zhuǎn)錄脈沖，它指的是并不是所有基因的基因轉(zhuǎn)錄都處于啟動階段，主要由捕獲時間來確定這些基因是打開還是關(guān)閉狀態(tài)；

       2、然后是每條RNA加工速度都不相同；

       3、環(huán)境刺激也會影響基因的表達；

       4、時序改變，指的是像細胞周期這樣的細胞時序變化過程，會影響單個細胞的基因表達譜。

       單細胞測序的第三個缺陷是樣品之間的技術(shù)差異，主要包括：

       1、細胞特異性捕獲效率不同，不同細胞捕獲轉(zhuǎn)錄本不同，導(dǎo)致測序深度不同；

       2、文庫質(zhì)量：獲得的樣品中會存在降解的RNA、低存活力細胞、大量自由漂浮的RNA以及細胞定量不準確，這些導(dǎo)致質(zhì)量指標降低；

       3、擴增偏差：在文庫制備的擴增步驟中，并非所有轉(zhuǎn)錄本都擴增到相同水平；

       4、批次效應(yīng)：可以從圖中看到因為批次不同造成細胞表達顯著性差異，這就要求在實驗中最好在同一天、同一個人在同一個地點完成所有RNA分離及建庫工作來盡量避免批次效應(yīng)。

       當前單細胞測序用到的兩種主流技術(shù)主要為10x Genomics和smart-seq，他們有各自的優(yōu)缺點。

       首先是smart-seq 的大致步驟：細胞制成單細胞懸液、帶poly（A）尾的RNA逆轉(zhuǎn)錄、模版轉(zhuǎn)換、cDNA的擴增、cDNA片段化、加入文庫PCR引物進行擴增、測序。

       它的優(yōu)點主要在于相對于截短的cDNAs，該技術(shù)所采用的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶更傾向于選擇全長cDNAs作為其末端轉(zhuǎn)移酶活性的底物。因此它的測序深度大大增加，基本每個轉(zhuǎn)錄本的所有外顯子都能被檢測到，這使它可以用于檢測可變剪接，還可以在轉(zhuǎn)錄本層面進行全面的突變分析，擴大了其應(yīng)用范圍。

       此外它的優(yōu)點還包括：

       1、進行技術(shù)改進后，Smart-seq2利用現(xiàn)成的試劑能生產(chǎn)更高質(zhì)量的文庫，且成本也有所下降，為分析大量細胞提供了可能性。

       2、Smart-seq2的方案組分和原理是公開的，讓研究人員可以進一步對其進行改良，目前在這個方案基礎(chǔ)上涌現(xiàn)了許多單細胞測序的新成果。

       它的缺陷是：建庫過程依賴于孔板，這使得它們難以達到很高的通量，smart-seq是基于96孔板的，那么同批次只能測96個細胞。

       Microwell 通過縮小孔體積來增加細胞數(shù)量，但依然受到限制。

       它的另一個缺陷是因為引物的設(shè)計，只能選擇性識別聚腺苷酸化的RNA，所以不能分析沒有poly（A）的RNA。

       接下來是10x Genomics，它是依賴于液滴的，大致步驟就是通過微流控技術(shù)將單個細胞和一個捕獲RNA的微珠包裹在液滴中，微珠連接的捕獲mRNa上已經(jīng)預(yù)先包含UMI和細胞條形碼信息，讓每個液滴帶上獨特信息，在液滴中完成mRNA的富集后將微珠合并，完成測序。

       它的優(yōu)點在于：

       1、在該方法中，含有細胞的油滴占所有油滴比例大約5%，這樣能夠更好地保證了含細胞的液滴中只含有一個細胞。

       2、每個液滴中均含有獨特的細胞條形碼和UMI，能夠區(qū)分單細胞。

       3、而且它不受限于孔板，可以短時間內(nèi)同批次處理更多的細胞。

       它的缺陷在于：

       1、微珠對mRNA的捕獲效率有限，在獲得細胞數(shù)量的突破的同時，能夠測得的細胞基因數(shù)較少，就是測序深度比較低。

       2、而且該技術(shù)測序多為3‘端測序，測得的序列相同性很高，靈敏度和準確度都不及全場測序。

       PART. 04

       結(jié)語

       scRNA-seq為異質(zhì)性問題的解決提供轉(zhuǎn)錄組水平的解決方法，自這項技術(shù)問世以來，它就在飛速發(fā)展的同時得到了廣泛的應(yīng)用，從基因表達到細胞分群，再到譜系分析，scRNA-seq將這些點連成線，為今天的藥物研發(fā)提供了更多的方向。scRNA-seq在今天大放異彩，在未來的表現(xiàn)也同樣令人期待。

       關(guān)于筆者

       尋藥真理團

       他們是南京大學(xué)新藥研發(fā)策略課程的學(xué)生，本篇為該課程中杜軼翔、徐倩、徐思瓊、李飛4名同學(xué)共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚，他們腳踏實地學(xué)習(xí)新藥研發(fā)知識，他們堅信吾愛吾師吾更愛真理。

       他們是新一代醫(yī)藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領(lǐng)域的未來之光！

       參考文獻：

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