TREG療法:通向腎器官移植領(lǐng)域圣杯的希望？

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來源：藥渡

2020-12-28

如何提高移植物和移植受者的長(zhǎng)期存活率是移植學(xué)研究的主題，其中，對(duì)于免疫抑制劑的研究占據(jù)著重要的地位，而免疫抑制劑一面是其抗排斥反應(yīng)療效，另一面則是其不良反應(yīng)。

如何提高移植物和移植受者的長(zhǎng)期存活率是移植學(xué)研究的主題，其中，對(duì)于免疫抑制劑的研究占據(jù)著重要的地位，而免疫抑制劑一面是其抗排斥反應(yīng)療效，另一面則是其不良反應(yīng)。免疫抑制劑能抑制與免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞（主要是T細(xì)胞和B細(xì)胞）的增殖和功能，降低免疫應(yīng)答。由于各種免疫抑制劑的作用機(jī)制不同且其不良反應(yīng)的程度多與使用劑量有關(guān)，因此，針對(duì)移植排斥反應(yīng)發(fā)生的不同靶點(diǎn)和關(guān)鍵步驟常采用多種免疫抑制劑聯(lián)合的方案，這樣既可協(xié)同增強(qiáng)免疫抑制效果，又可降低各種免疫抑制劑的劑量和不良反應(yīng)的發(fā)生率。

APC 為抗原提呈細(xì)胞；IL為白細(xì)胞介素；TCR為T細(xì)胞受體；JAK為Janus激酶；PI3K為磷脂酰肌醇-3-激酶；mTOR為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；CN為鈣調(diào)磷酸酶；MAP激酶為有絲分裂原活化蛋白激酶；IKK為核因子-κB激酶抑制劑；NFAT為活化T細(xì)胞核因子；AP-1為激活蛋白因子；CKD/cyclins 為周期蛋白依賴激酶；IMPDH為次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。

近十年來，Treg細(xì)胞療法在一系列與移植相關(guān)和非移植相關(guān)的適應(yīng)癥上進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。雖然這些試驗(yàn)都集中在安全性上，但所有試驗(yàn)的一個(gè)核心主題是GMP方案在細(xì)胞分離、操作、擴(kuò)增、劑量、特異性和給藥后細(xì)胞跟蹤方面的異質(zhì)性。目前Treg在標(biāo)準(zhǔn)化方面達(dá)成了一些共識(shí)，但現(xiàn)實(shí)是Treg細(xì)胞的新穎性要求進(jìn)行大量的人體研究和專注于GMP條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化。部分研究更多的想要制造更純的細(xì)胞，這種想法基于供體反應(yīng)特異性TREG比多克隆TREG能更好的治療移植效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)。在人類中闡明和利用這一機(jī)制是很重要的，因?yàn)楫a(chǎn)物純度和同種異體抗原特異性的程度可能會(huì)對(duì)治療效果和輸注細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生影響。腎臟的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是活體供者有更大的后勤保障范圍，這就提供了連續(xù)獲取新鮮供者抗原的途徑，從而提供了供者特異性的Treg細(xì)胞。

01、Treg分類

由于慢性同種異體移植功能障礙和免疫抑制的長(zhǎng)期副作用尚未完全解決，移植耐受仍然是器官移植領(lǐng)域的圣杯。在這一點(diǎn)上，外周循環(huán)和移植物微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的增加被認(rèn)為是誘導(dǎo)移植物耐受的重要因素。

人和鼠的多克隆Treg細(xì)胞被經(jīng)典地分為胸腺Treg細(xì)胞(tTreg)、外周Treg細(xì)胞(pTreg)和誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞(iTreg)三大類，一些學(xué)者通過tTreg細(xì)胞上Helios和Neuropilin-1(NRP-1)的高表達(dá)來區(qū)分tTreg細(xì)胞和pTreg細(xì)胞。然而，Helios/NRP-1本身不能對(duì)人類的tTregs和pTreg細(xì)胞進(jìn)行分類。

外周循環(huán)中Treg細(xì)胞的特征是CD4+，高水平的IL-2受體α鏈(CD25high)，低水平的CD127和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)叉頭盒P3轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3+)。新的深層免疫表型技術(shù)的采用證實(shí)了這種表型比最初認(rèn)為的更具異質(zhì)性，這些數(shù)據(jù)因Treg細(xì)胞的種類、類型、分化狀態(tài)和微環(huán)境的不同而不同。進(jìn)一步的區(qū)分是通過鑒定趨化因子受體。

02、目前研究報(bào)道的Treg細(xì)胞的特別性質(zhì)

A:Treg細(xì)胞的可塑性

Treg細(xì)胞在炎性微環(huán)境中采用Th17樣效應(yīng)細(xì)胞表型和功能的可能性是一個(gè)關(guān)鍵的安全問題。這是因?yàn)門h17細(xì)胞在急性和慢性同種異體移植排斥反應(yīng)患者中升高，因此可能導(dǎo)致這兩種情況的惡化。另一種與Treg-Th17相互作用有關(guān)的途徑是，兩者最初都起源于Naive CD4+細(xì)胞，但其隨后的分化途徑分別由微環(huán)境中不含IL-6的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(針對(duì)Treg)或與IL-6(針對(duì)Th17)的存在所決定。微環(huán)境將Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促進(jìn)排斥反應(yīng)的Th17細(xì)胞的潛力可能決定了輸注Treg細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)。理論上，Treg細(xì)胞治療可以是主動(dòng)的(即在患者發(fā)生排斥反應(yīng)之前)，也可以是反應(yīng)性的(即給予診斷為急性或慢性排斥的患者)。然而，目前尚不清楚Treg細(xì)胞能否在已經(jīng)被Teffs滲透的微環(huán)境中誘導(dǎo)耐受。

B: 旁觀者壓制效應(yīng)

Treg細(xì)胞治療可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)潛在的問題，因?yàn)門reg細(xì)胞一旦被激活，就可以以一種非抗原特異性的方式執(zhí)行它們的抑制功能。這種被稱為“旁觀者抑制”的效應(yīng)是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，抗原特異性的CD4+CD25+T細(xì)胞最初需要與TCR介導(dǎo)的互補(bǔ)表位接觸才能激活。然而，一旦激活，這些細(xì)胞也能夠抑制第三方抗原特異性的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞。這一效應(yīng)在同種異體皮膚移植的小鼠體內(nèi)模型中也得到了證實(shí)。如果這一現(xiàn)象確實(shí)在我們的患者中重復(fù)出現(xiàn)，可能會(huì)對(duì)調(diào)節(jié)抗原特異性排斥反應(yīng)，同時(shí)保持對(duì)病原體和潛在腫瘤新表位的免疫力產(chǎn)生影響。

03、TREG代表性試驗(yàn)

A. TRACT試驗(yàn)

試驗(yàn)招募9人，細(xì)胞分離采用Clinimacs系統(tǒng)，3周擴(kuò)增過程中采用抗CD3/CD28拮抗劑、IL-2、TGF-β、西羅莫司。最后得到純度>98% CD4+CD25+和>80% FOXP3+以及相似的去甲基化水平。患者在移植當(dāng)天和術(shù)后第2天接受alemtuzumab治療，并維持使用MMF和他克莫司(第30天改用西羅莫司)。Treg細(xì)胞隨后在第60天被輸注。在報(bào)告的兩年中，沒有巨細(xì)胞病毒或多瘤病毒引起的機(jī)會(huì)性感染病例，也沒有發(fā)生排斥反應(yīng)。這項(xiàng)試驗(yàn)沒有報(bào)道在接受新腎移植的患者輸注多克隆Treg細(xì)胞后發(fā)生機(jī)會(huì)性感染或排斥反應(yīng)的病例。

B. TASK試驗(yàn)

相比之下，TASK試驗(yàn)集中在利用多克隆Treg細(xì)胞來調(diào)節(jié)移植腎的亞臨床炎癥。這是一個(gè)重要的研究問題，因?yàn)閬喤R床炎癥由于其慢性低級(jí)別的性質(zhì)而沒有得到及時(shí)的診斷，并可能導(dǎo)致遲發(fā)性同種異體移植物功能障礙。

患者接受體外擴(kuò)增的自體Treg細(xì)胞，平均劑量為320*106個(gè)細(xì)胞。2周擴(kuò)增：抗CD3/CD28拮抗劑，IL-2，重氫葡萄糖處理。最終得到純度>97%CD4+和>93% FOXP3+和<0.37% CD8+的產(chǎn)品。

試驗(yàn)招募了三名患者，他們?cè)谝浦埠?個(gè)月的活組織檢查中表現(xiàn)出這種炎癥(Banff i-和t-<2)。當(dāng)患者獲得Treg細(xì)胞時(shí)，他們已經(jīng)在服用MMF、他克莫司和強(qiáng)的松龍。重要的是，從安全性的角度來看，試驗(yàn)報(bào)告說， Treg產(chǎn)品沒有直接導(dǎo)致SAE，在一年的隨訪期內(nèi)也沒有報(bào)告感染或移植物功能障礙。然而，當(dāng)前試驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵限制是，與另外一個(gè)試驗(yàn)中超過12個(gè)月的檢測(cè)不到的情況相比，氘信號(hào)在3個(gè)月內(nèi)無法檢測(cè)到。這就否定了這種技術(shù)的長(zhǎng)期使用。在輸注后2周和6個(gè)月的腎活檢中，還沒有發(fā)現(xiàn)這些Treg細(xì)胞的報(bào)道。因此，目前還不清楚脫氫Treg細(xì)胞的產(chǎn)物是否能夠遷移到移植物中。補(bǔ)充這一事實(shí)的是，在輸注后2周，沒有患者在腎活檢組織中顯示FOXP3+%的表達(dá)增加，只有1例患者在6個(gè)月時(shí)出現(xiàn)這種情況。此外，盡管這項(xiàng)技術(shù)有助于短期追蹤，但它并不提供有關(guān)活體Treg功能的知識(shí)?？偠灾谀I移植中，在輸注FACS分離和多克隆擴(kuò)增的德化Treg細(xì)胞后，沒有出現(xiàn)SAE。TASK試驗(yàn)?zāi)壳罢诒容^多克隆和同種異體抗原特異性Treg細(xì)胞的療效(NCT02711826)。

C. ONE試驗(yàn)（德國）

ONE試驗(yàn)是評(píng)估腎移植后通過輸注自體自然調(diào)節(jié)T細(xì)胞(nTreg)來重塑患者的免疫平衡是否安全、可行，并使終生大劑量免疫抑制(其療效有限、不良反應(yīng)、高直接和間接成本)逐漸減少，同時(shí)在有用的概念驗(yàn)證疾病模型中解決nTreg治療的幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)，例如簡(jiǎn)單可靠的制造、過度免疫抑制的危險(xiǎn)、與標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理藥物的相互作用以及炎癥環(huán)境中的功能穩(wěn)定性。

參與者：活體供腎移植受者(ONEnTreg13，n=11)和相應(yīng)的參照組試驗(yàn)(ONErgt11-CHA，n=9)。

干預(yù)方式：CD4+CD25+FoxP3+nTreg產(chǎn)品在腎移植后7天靜脈注射0.5、1.0或2.5-3.0×106細(xì)胞/kg體重，隨后逐步減少三重免疫抑制至小劑量他克莫司單藥治療，直至48周。

結(jié)果測(cè)量：主要臨床和安全終點(diǎn)在第60周由一個(gè)綜合終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行進(jìn)一步的三年隨訪。評(píng)估包括活檢證實(shí)的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，對(duì)注射nTreg相關(guān)不良反應(yīng)的評(píng)估，以及過度免疫抑制的跡象。次要終點(diǎn)包括同種異體移植的功能、全面的探索性生物標(biāo)志物組合等。

對(duì)于所有患者來說，在腎移植前兩周采集40-50毫升的外周血液就可以生產(chǎn)出產(chǎn)量、純度和功能性都足夠高的nTreg產(chǎn)品。三個(gè)nTreg劑量遞增組均無劑量限制性**。nTreg組和參照組的同種異體移植物三年存活率為100%，臨床和安全性特征相似。在接受nTregs治療的11名患者中，有8名(73%)獲得了穩(wěn)定的單藥免疫抑制，而對(duì)照組仍在接受標(biāo)準(zhǔn)的二聯(lián)或三聯(lián)藥物免疫抑制(P=0.002)。

在這個(gè)試驗(yàn)中第一：沒有任何炎癥反應(yīng)跡象。第二：沒有看到任何過度免疫抑制的臨床感染現(xiàn)象，這之前是假定的安全性問題。作者認(rèn)為，在沒有T細(xì)胞受體或CD28刺激的情況下，Treg細(xì)胞在幾天內(nèi)失去激活，甚至死亡。因此，只有經(jīng)過反復(fù)抗原刺激的Treg克隆才能保持其抑制能力，并能在體內(nèi)擴(kuò)張。第三，作者觀察到輸注的Treg產(chǎn)物的多克隆T細(xì)胞受體在體內(nèi)隨著時(shí)間的推移而轉(zhuǎn)變?yōu)楣芽寺∧Ｊ?，這表明了同種異體抗原驅(qū)動(dòng)的選擇過程。同樣，在體外用同種異體抗原替代抗CD3/28的多克隆抗體，在幾天內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)偏向的T細(xì)胞受體譜系，這表明即使在注射多克隆nTregs之后，也有特異性的免疫調(diào)節(jié)作用。第四，注射nTreg僅導(dǎo)致Treg計(jì)數(shù)暫時(shí)增加。四周后循環(huán)Tregs減少的原因可能是nTregs集中于發(fā)炎的移植物或缺乏持久的植入物。最后，nTreg組表達(dá)了較少的常規(guī)T細(xì)胞激活，自然殺傷細(xì)胞成熟，這可能表明nTreg在體內(nèi)的作用方式。需要強(qiáng)調(diào)的是這個(gè)試驗(yàn)中有數(shù)據(jù)表明nTregs聯(lián)合小劑量他克莫司單一療法不能充分控制先前存在的致病記憶或效應(yīng)免疫細(xì)胞。這一假說應(yīng)該在后續(xù)研究中仔細(xì)研究。

04、Treg療法總結(jié)

目前有兩種主要的方法制造Treg細(xì)胞：在體內(nèi)擴(kuò)增Treg細(xì)胞和在GMP條件下體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞。大多數(shù)中心都專注于Treg的體外擴(kuò)增，比較這兩種方法的數(shù)據(jù)對(duì)于確定臨床上利用Tregs的最佳方法至關(guān)重要。此外關(guān)于Treg異質(zhì)性的討論將有助于臨床安全方案的開發(fā)。

未來的另一個(gè)關(guān)鍵問題將是Treg細(xì)胞治療試驗(yàn)中的免疫抑制管理。根據(jù)移植中心的方案，不同的患者目前接受不同的免疫抑制方案(例如：不使用類固醇，推遲鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的引入)，劑量不同。在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，考慮到這些免疫抑制劑是很重要的，因?yàn)橥瑫r(shí)免疫抑制可以調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的存活和功能。另一個(gè)未解決的問題是，Treg細(xì)胞的基因修飾是否可以增強(qiáng)它們對(duì)移植排斥反應(yīng)的體內(nèi)調(diào)節(jié)。關(guān)于Treg的異質(zhì)性，盡管新技術(shù)可能有助于加深對(duì)Treg細(xì)胞及其亞群的理解，但將這些技術(shù)用于常規(guī)臨床用途是不切實(shí)際的，在經(jīng)濟(jì)上也是不可行的。因此，關(guān)鍵問題是，我們需要深入到什么程度？我們可能只利用昂貴的新技術(shù)進(jìn)行臨床前實(shí)驗(yàn)，以確定和驗(yàn)證Treg細(xì)胞以獲得最佳的體內(nèi)活性。然后，可以對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行反向工程，使其適用于臨床可用的分析，以便于在更大規(guī)模的多中心試驗(yàn)中使用。

目前Treg療法盡管試驗(yàn)數(shù)據(jù)有限，但在安全性和有效性已經(jīng)初步顯示出了療效。隨著基礎(chǔ)科學(xué)研究的發(fā)展和進(jìn)一步的臨床研究，相信Treg細(xì)胞在腎移植的應(yīng)用潛力會(huì)逐步釋放。

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