RAS癌基因突變是人類癌癥中最常見的激活突變，發(fā)生在30%的人類腫瘤中。盡管是最早發(fā)現(xiàn)的癌基因之一，但三十年的努力一直未能識(shí)別出臨床上可行的KRAS蛋白抑制劑，主要有兩個(gè)原因：(1)KRAS以皮摩爾親和力與GDP和GTP結(jié)合，嚴(yán)重阻礙了開發(fā)核苷酸競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的努力；(2)KRAS蛋白缺乏其它深表面疏水口袋，阻礙了尋找高親和力變構(gòu)抑制劑的努力[1][2][3]。

       事情在2013年出現(xiàn)了重大突破，Shokat等[4]報(bào)告了一種旨在克服這些挑戰(zhàn)的新策略，該策略使用共價(jià)抑制劑來靶向KRASG12C的活性半胱氨酸。[5]。結(jié)晶學(xué)研究表明，在效應(yīng)因子結(jié)合的Switch-II區(qū)域的下面形成了一個(gè)新的口袋，值得注意的是，突變體cys12位于與效應(yīng)因子相互作用有關(guān)的核苷酸口袋和切換區(qū)附近，基于二硫化物的片段篩選法在GDP結(jié)合狀態(tài)下利用完整蛋白質(zhì)質(zhì)譜法對(duì)有480個(gè)系鏈化合物的文庫(kù)進(jìn)行了篩選，得到了片段6H05和2E07，且兩個(gè)片段化合物未檢測(cè)到與含有3個(gè)天然半胱氨酸殘基的野生型K-RAS的反應(yīng)。

       選取最優(yōu)片段6H05進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，得到了最高活性化學(xué)物(6)，化合物6不結(jié)合在核苷酸口袋中，而是從Cys12延伸到主要由Switch-II組成的相鄰口袋中。這種完全形成的口袋在RAS的其他已發(fā)表的結(jié)構(gòu)中并不明顯，盡管在某些情況下可以看到凹槽，以前的研究表明這個(gè)區(qū)域存在變構(gòu)位點(diǎn)。將復(fù)合結(jié)合區(qū)稱為Switch-II口袋(S-IIP) [4]。

       S-IIP位于RAS的中心β-折疊與α2-(Switch-II)和α3-螺旋之間，明確的電子密度顯示了化合物6在S-IIP內(nèi)部的位置，并證實(shí)了6與Cys12之間的二硫鍵。6的疏水二氯苯基形成幾個(gè)疏水接觸。Glu99和Gly60形成直接氫鍵至6。而Switch-II對(duì)形成S-IIP有明顯的重排作用，Switch-I的構(gòu)象沒有從GDP結(jié)合狀態(tài)改變[4]。

       Shokat等沒有繼續(xù)使用基于二硫化物的化合物，而是轉(zhuǎn)向了碳基親電劑、丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺，得到了高效的丙烯酰胺類化合物，其中化合物12活性很好。同時(shí)又證明了化合物12不和野生型KRAS的半胱氨酸反應(yīng)。覆蓋多個(gè)共晶結(jié)構(gòu)表明，化合物通過口袋遵循類似的軌跡，并將官能團(tuán)投射到(o-)和(p-)子口袋中。盡管末端苯環(huán)上有相當(dāng)大的差異，但這些化合物滿足相似的疏水相互作用，支持S-IIP的這一區(qū)域的關(guān)鍵作用 [4]。

       EDTA對(duì)核苷酸交換的催化作用表明，雖然化合物可能會(huì)微妙地影響金屬結(jié)合，導(dǎo)致核苷酸親和力的變化，但即使在S-IIP被占據(jù)的情況下，Mg2+也不能被排除。結(jié)構(gòu)分析還預(yù)測(cè)，交換因子SOS的功能可能會(huì)受到與S-IIP結(jié)合的影響。用化合物8或12阻斷SOS催化的核苷酸交換處理K-RAS(G12C)，如上所述，這些化合物不會(huì)損害EDTA催化的GDP交換[4]。

       接著用免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)了化合物12將破壞RAS的GTP狀態(tài)的構(gòu)象，并損害與效應(yīng)因子(如Raf)的相互作用。在一小部分基因表型的肺癌細(xì)胞系中研究了化合物12的作用。如預(yù)期的那樣，與沒有G12C突變的組(H1437、H1299和A549)相比，含有G12C突變的細(xì)胞系(H1792、H358、H23和CALU-1)在處理后顯示出存活率降低和凋亡增加。高敏感的H1792細(xì)胞顯示低水平的K-RASGTP，與抑制劑與K-RAS GDP的優(yōu)先結(jié)合一致。它們是高度依賴K-RAS的。值得注意的是，缺乏G12C的K-RAS依賴性(A549)和非依賴性(H1299)細(xì)胞株對(duì)化合物12不敏感?；衔?2在H1792細(xì)胞中的半數(shù)有效濃度(EC50)為0.32±0.01 μM[4]。

       總體而言，細(xì)胞數(shù)據(jù)為S-IIP結(jié)合復(fù)合物在K-RASG12C驅(qū)動(dòng)的癌癥中的基因型特異性使用提供了概念驗(yàn)證。

       Matthew P. Patricelli等[6]在化合物12的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索，發(fā)現(xiàn)化合物12在含有KRASG12C突變的NCI-H358(H358)細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性的KRASG12C共結(jié)合，即使在100 μmol/L化合物處理6小時(shí)后也沒有表現(xiàn)出明顯的KRAS 共結(jié)合。為了解決化合物12缺乏細(xì)胞活性的可能原因，需要更有效的Switch II口袋抑制劑，進(jìn)行了基于迭代結(jié)構(gòu)的共價(jià)KRASG12C靶向試劑的設(shè)計(jì)，并測(cè)試了它們對(duì)純化的重組KRASG12C的活性以及它們?cè)诩?xì)胞中結(jié)合KRAS G12C的能力。ARS-853，給出了很大的希望。

       在生化測(cè)定中，ARS-853與KRASG12C的結(jié)合速率常數(shù)為76M-1s-1，比化合物12提高了600多倍，細(xì)胞結(jié)合IC50在6小時(shí)為1.6 μmol/L。在GDP存在下，配體結(jié)合的KRASG12C的高分辨晶體結(jié)構(gòu)將ARS-853的結(jié)合位點(diǎn)確定為前面描述的開關(guān)II口袋。在該結(jié)構(gòu)中，ARS853共價(jià)連接到C12上，并延伸到位于KRAS的中心β-折疊與α2和α3螺旋之間的Switch II口袋區(qū)域。相對(duì)于其他已發(fā)表的開關(guān)II結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)，ARS853誘導(dǎo)α2螺旋的旋轉(zhuǎn)，伴隨著M72的位移，以適應(yīng)不同疏水口袋中的配體。這個(gè)疏水口袋被ARS-853的芳環(huán)占據(jù)，氯和甲基環(huán)丙基取代基提供了緊密的范德華接觸，而酚羥基與D69形成了氫鍵。ARS-853丙烯酰胺的羰基與保守的K16和一個(gè)與通常的鎂離子配位的水分子形成氫鍵，同時(shí)占據(jù)與KRAS的GTP結(jié)合形式的末端磷酸相似的位置。總體而言，該結(jié)構(gòu)的多個(gè)特征表明，ARS-853結(jié)合的KRASG12C代表KRAS的非活性狀態(tài)。[6]。

       Matthew R. Janes等[6]進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)說明了ARS-853抑制KRASG12C癌蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能，ARS-853細(xì)胞參與需要KRAS G12C癌蛋白上的核苷酸快速循環(huán)，KRAS G12C GTP水平受上游信號(hào)因子調(diào)控。

       盡管獲得了以上的突破，揭示以前未知的RAS結(jié)合口袋，研究者們也開展了大量的篩選試驗(yàn)，但它們只導(dǎo)致了有限的證明，同時(shí)都嚴(yán)重缺乏對(duì)靶向作用機(jī)制的令人信服的體內(nèi)反應(yīng)的證明[7][8]。Matthew R. Janes等[9]基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，繼續(xù)提高突變導(dǎo)向和KRAS特異性抑制劑的效力和類藥物特性。研究發(fā)現(xiàn)ARS-853系列化合物的主要缺點(diǎn)是血漿代謝穩(wěn)定性短(t1/2<20min)和小鼠口服生物利用度差(F<2%)，使其不能用于進(jìn)一步的體內(nèi)研究。有限的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系也限制了ARS-853系列的進(jìn)一步效力改進(jìn)。將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)上不同的支架上，這些支架適當(dāng)?shù)囟ㄎ槐０返臉?gòu)象和軌跡，并允許最佳的疏水結(jié)合部分在S-IIP中的適當(dāng)放置。我們假設(shè)ARS-853系列的柔性2-氨基-1-(π-哌嗪-1-基)乙烷-1-酮連接子可以縮短并被更剛性的雙環(huán)支架取代，并適合由之前報(bào)道的ARS-853共晶結(jié)構(gòu)重新封裝的S-II和A3螺旋之間的空閑區(qū)域[6]。經(jīng)過廣泛的支架優(yōu)化，我們確定喹唑啉核心是一種多功能支架，可以克服ARS-853的SAR限制，并具有更好的類藥物特性。

       這一進(jìn)展導(dǎo)致了基于喹唑啉的系列，并在對(duì)支架周圍的取代基進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化之后，導(dǎo)致具有良好ADME/PK以及KRAS共價(jià)結(jié)合活性的顯著改善[9]。

       繼續(xù)合成了幾個(gè)喹唑啉系列活性較高的化合物，最引人關(guān)注的是化合物ARS-1620，它含有一個(gè)氟苯酚疏水結(jié)合部分，具有軸向手性，表現(xiàn)了S-阿托品對(duì)KRAS-12半胱氨酸的異構(gòu)體反應(yīng)性 [9]。

       ARS-1620與KRASG12C結(jié)合的共晶結(jié)構(gòu)顯示了從最初的S-IIP KRASG12C抑制劑到Cys-12的獨(dú)特結(jié)合模式和結(jié)合軌跡，并揭示了與His-95額外的關(guān)鍵相互作用的獲得，從而獲得了比ARS-853系列化合物更剛性、更有利的共價(jià)反應(yīng)構(gòu)象 [9]。

       在生化實(shí)驗(yàn)中，ARS-1620共價(jià)修飾KRASG12C的觀察速率比ARS-853提高了10倍，證明了ARS-1620對(duì)KRAS的修飾效力比以前的化合物有了明顯的提高。ARS-1620優(yōu)先與KRASG12C的GDP結(jié)合狀態(tài)作用，缺乏對(duì)野生型(WT)-KRAS蛋白的任何殘基的可檢測(cè)到的反應(yīng)性。此外，與ARS-1620共價(jià)結(jié)合的KRAS G12C缺乏SOS和EDTA介導(dǎo)的核苷酸交換能力。同時(shí)在細(xì)胞層面證實(shí)了ARS-1620的抑制活性，Pan-RAS中對(duì)KRASG12C的選擇性[9]。

       共價(jià)抑制劑的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)是可能與非靶蛋白發(fā)生非特異性反應(yīng)。ATP口袋附近有200個(gè)帶有反應(yīng)性半胱氨酸的激酶[10]，同樣地延伸到含有反應(yīng)性半胱氨酸的非激酶蛋白[11]，如果被靶向，可能會(huì)產(chǎn)生不必要的特異性**。為了更好地定義ARS-1620可能的脫靶易感性和特異性，使用無偏見的化學(xué)蛋白質(zhì)組篩選來評(píng)估細(xì)胞內(nèi)的共價(jià)反應(yīng)活性，分辨率覆蓋3012個(gè)注釋蛋白質(zhì)的8501個(gè)半胱氨酸殘基，最終證實(shí)了ARS-1620 靶點(diǎn)專一性[9]。

       ARS-1620在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出極好的口服生物利用度和足夠的血液穩(wěn)定性，使得可以定量測(cè)量體內(nèi)G12C靶點(diǎn)占有率。目前仍不清楚ARS-1620是否能夠滿足足夠的共價(jià)動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性，以使S-IIP G12C靶向方法在體內(nèi)成功。為了說明ARS-1620是否具有體內(nèi)靶點(diǎn)占有率的能力，在已建立的攜帶KRAS p.G12C的異種皮下移植模型中口服了ARS-1620。在單次口服劑量或連續(xù)5次每日劑量后，ARS-1620產(chǎn)生的平均腫瘤峰值濃度分別為1.5 μM (50 mg/kg)和6.5 μM(200 mg/kg)，這使得KRAS G12C靶點(diǎn)占據(jù)顯著(≥70% G12C-TE在200 mg/kg)超過24小時(shí)。在這些暴露下，ARS-1620提供了顯著的G12C目標(biāo)占有率(75%至90%G12C-TE)以及RAS-GTP和下游信號(hào)抑制[9]。

       接下來，通過動(dòng)物模型試驗(yàn)證明了目標(biāo)占有率能轉(zhuǎn)化為體內(nèi)的抗腫瘤活性。[9]。

       對(duì)KRAS依賴性的系統(tǒng)評(píng)估揭示了體外和體內(nèi)腫瘤模型對(duì)KRAS抑制的不同敏感性，也體現(xiàn)了3D-橢球體系統(tǒng)能很好的預(yù)測(cè)體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)活性。[9]。

       最后在在PDX腫瘤模型中證明了ARS-1620有效和選擇性的抗腫瘤活性。值得注意的是PDX1868含有EGFR T790M、L858R驅(qū)動(dòng)突變，PDX0170在PMS2，MSH2，MSH6和APC中存在Lynch綜合征突變。在所有采用的腫瘤模型中，ARS-1620在整個(gè)3周的治療期間耐受性良好。此外，在CD-1小鼠身上沒有觀察到ARS-1620的臨床癥狀或**，即使在7天內(nèi)每天口服劑量高達(dá)1000毫克/公斤。在400 mg/kg以上，ARS-1620抑制了PK飽和度，因此在細(xì)胞系和PDX來源的模型中沒有進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果[9]。

       總體而言，ARS-1620作為單一藥物在NSCLC模型中廣泛有效的體內(nèi)證據(jù)提供了概念證明，即相當(dāng)大一部分p.G12C KRAS突變的患者可能受益于KRAS G12C導(dǎo)向的治療。Matthew R. Janes等對(duì)于ARS-1620研究提供了第一個(gè)體內(nèi)證據(jù)，證明S-IIP靶向治療方法可能是治療KRAS p.G12C突變癌癥患者的一種有前途的治療策略。

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