新型冠狀病毒肺炎疫情在國內(nèi)已逐漸平穩(wěn)，全球疫情卻正處爆發(fā)期。當(dāng)各國不得不開始重視起疫情的控制時，首先要解決的就是新型冠狀病毒的檢測問題?；仡檱鴥?nèi)的抗疫歷程，我們很早就確立了核酸檢測作為新型冠狀病毒肺炎的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但曾有很多臨床醫(yī)生強烈反映核酸檢測出現(xiàn)了“假陰性”的情況，即對于一些臨床、影像學(xué)和流行病學(xué)特征都高度提示新冠的患者，核酸檢測結(jié)果卻為陰性，甚至有的患者需要3次以上核酸檢測才第一次返回陽性結(jié)果。要理解并解決“假陰性”的問題，我們需要對新型冠狀病毒的檢測原理和過程有一個基礎(chǔ)的了解。

       一、新型冠狀病毒核酸檢測，到底在檢測什么？

       新型冠狀病毒的檢測目前有2種方法，第一種是核酸檢測，第二種是抗體檢測。核酸檢測的對象是病毒的RNA，抗體檢測的對象是機體在免疫過程中產(chǎn)生的與病毒蛋白特異性結(jié)合的抗體。

       RNA可以理解為病毒的遺傳密碼，是由數(shù)萬個密碼子連接而成的單鏈密碼串。對RNA的檢測實際上只需要選擇這長串密碼中特異性的位點，如果特異性位點中的密碼序列符合，那么就可以確認(rèn)標(biāo)本中存在新型冠狀病毒。實際檢測中，現(xiàn)有的核酸檢測都是檢測DNA的，所以在對標(biāo)本處理得到基因組RNA之后，往往需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補的cDNA。熒光RT-PCR是目前使用最廣泛的新型冠狀病毒核酸檢測方法，因其具有優(yōu)異的靈敏度和特異性并且快速簡單成本低。熒光RT-PCR的原理是首先把cDNA在PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增并使用熒光進(jìn)行標(biāo)記，每擴增一條DNA 鏈，就有一個熒光分子產(chǎn)生（圖2）。通過測定熒光達(dá)到一定閾值所需擴增循環(huán)數(shù)（Ct 值）來實現(xiàn)靶標(biāo)定量檢測。初始靶標(biāo)核酸的濃度越高，Ct 值越小。由于SARS-CoV-2屬于RNA病毒，容易發(fā)生變異，為防止錯檢和漏檢，PCR檢測一般會分別在ORF1ab基因、N基因選取2個靶標(biāo)，有時還會在E基因上選取第3個靶標(biāo)，以提高SARS-CoV-2的陽性檢出率。

       全基因組測序是新型冠狀病毒檢測的另外一種核酸檢測方法。對病毒進(jìn)行全基因組測序 可以幫助我們了解病毒的遺傳信息，最初新型冠狀病毒的鑒別就是通過基因測序進(jìn)行的，測序結(jié)果可以用于指導(dǎo)核酸檢測產(chǎn)品（如熒光RT-PCR）的設(shè)計，并對病毒進(jìn)行追蹤和溯源。測序技術(shù)的最大優(yōu)勢在于高敏感性、高準(zhǔn)確性，但測序技術(shù)由于儀器成本較高，依賴于專業(yè)人員對序列的解讀，且檢測時間較長，目前還不適用于大規(guī)模檢測。此外，其他核酸檢測方法還包括液滴數(shù)字PCR，基因芯片等，這些核酸檢測方法可以進(jìn)一步改善檢測的效率和精度，但由于設(shè)備和操作流程要求較高，也不適合緊急疫情期間的大規(guī)模應(yīng)用。由于RNA病毒容易發(fā)生變異，為防止錯檢和漏檢，用于SARS-CoV-2檢測的PCR檢測一般會分別在ORF1ab基因、N基因選取兩個靶標(biāo)，有時還會在E基因上選取第3個靶標(biāo)，以提高SARS-CoV-2的陽性檢出率。

       新型冠狀病毒抗體檢測原理是基于抗體與抗原的特異性結(jié)合這一特性，抗體是人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生用于對抗抗原的物質(zhì)。在人體感染SARS-CoV-2后，病毒會作為抗原刺激人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗體，因此可以通過檢測人體內(nèi)是否產(chǎn)生特異性的抗體來間接檢測是否感染SARS-CoV-2。檢測的抗體主要分為免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）兩類。lgM是機體初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體，一經(jīng)感染，立即產(chǎn)生，但持續(xù)時間不長，主要作為早期感染的指標(biāo)。lgG是機體再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體，產(chǎn)生時間晚，持續(xù)時間長，主要作為感染和既往感染的指標(biāo)。一般認(rèn)為在發(fā)病7天后體內(nèi)才開始出現(xiàn)IgM抗體，發(fā)病15天后開始出現(xiàn)IgG抗體。同時檢測lgM、lgG抗體可以提高檢測的準(zhǔn)確性，減少漏診?？贵w檢測的樣本主要是血清、血漿或全血。目前使用最廣泛的新型冠狀病毒抗體檢測方法為免疫色譜試紙條，其原理為預(yù)先在試紙條的檢測線（T線）上固定抗體（抗原檢測）或抗抗體（抗體檢測），在控制線（C線）上固定二抗，結(jié)合墊帶有免疫標(biāo)記的探針。一般探針為膠體金、乳膠粒子或熒光微球等具有比色或熒光信號的微顆粒。在樣品墊中加入待測樣本，樣本流至結(jié)合墊時，通過抗原–抗體相互作用與探針結(jié)合，形成樣本–探針復(fù)合物。當(dāng)流動至T線時，復(fù)合物會被T線上的抗體或者抗抗體捕獲，形成標(biāo)記三明治夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物，使T線顯色。T線和C線同時顯色表明待測標(biāo)本中含有病毒的抗原或者抗體，只有C線則表明無病毒抗原或抗體。免疫色譜試紙條法無需復(fù)雜的儀器，操作簡單，可直接目視判定結(jié)果，檢測時間只需十幾分鐘，適合于現(xiàn)場快速篩查。但其準(zhǔn)確度和靈敏度有限，可以作為新型冠狀病毒檢測的輔助方法。

       二、核酸檢測為什么是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，“假陰性”如何解釋？

       核酸檢測之所以是新型冠狀病毒肺炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是因為核酸檢測在本質(zhì)上是一種病原學(xué)檢測，即在標(biāo)本中檢測到了SARS-CoV-2特有的基因片段，那么除非標(biāo)本被污染，可以肯定患者存在SARS-CoV-2感染。目前嚴(yán)格執(zhí)行"三個陰性樣本隨機放在臨床標(biāo)本中間同時參與檢測全過程"的質(zhì)控策略，可以有效而及時地識別出標(biāo)本被污染的情況。臨床醫(yī)生曾反映強烈的核酸檢測"假陰性"概念，往往指的是患者的臨床癥狀及影像學(xué)證據(jù)高度疑似新型冠狀病毒肺炎，但2019-nCoV核酸檢測多次或始終為"陰性"。而對于檢驗實驗室而言，假陰性指的是所采集標(biāo)本中存在有足夠量的病毒，但卻沒有被檢出。導(dǎo)致“假陰性”的可能原因包括：

       被感染者細(xì)胞內(nèi)的病毒量不足：不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，例如感染初期可能體內(nèi)病毒量較低而無法檢出；不同部位中，肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

       標(biāo)本采集時未采集到含病毒的細(xì)胞：采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，則可能采集到的細(xì)胞絕大部分都是不含病毒的細(xì)胞。

       檢測試劑的可靠性不足：任何一種檢測試劑的檢測范圍都存在下限，病毒數(shù)量低于檢測下限時是無法檢出的。此外，若原始標(biāo)本中病毒數(shù)量低于一定程度，就很可能在核酸擴增檢測的反應(yīng)體系中沒有病毒核酸，試劑也就無法檢出。

       實驗室質(zhì)量控制不規(guī)范：例如未嚴(yán)格遵守標(biāo)本運輸?shù)臏囟群蜁r間要求，檢測操作或者結(jié)果判讀不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)取?/p>

       根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》，新型冠狀病毒檢測陽性結(jié)果的報告要求滿足以下任一條：（1）ORF1ab和N基因同時陽性時，判定為陽性；（2）若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結(jié)果陽性時，需重新提取原標(biāo)本的核酸進(jìn)行復(fù)查，復(fù)查后ORF1ab或N基因仍為陽性時，判定為陽性。陰性結(jié)果的報告要求為兩個位點擴增結(jié)果都無反應(yīng)。其余情況都認(rèn)為“可疑結(jié)果”，需要換用不同廠家或者敏感度更高的檢測方法進(jìn)行確認(rèn)，并建議建議臨床重新采集標(biāo)本或更換部位采集標(biāo)本再次檢測。對于核酸檢測報告的陰性結(jié)果，需要結(jié)合患者的臨床特征進(jìn)行綜合判定，如果患者的癥狀、流行病學(xué)和胸部CT表現(xiàn)都高度提示感染時，很可能是因為標(biāo)本中病毒量低于檢測下限而未被檢出，該情況下建議重新采集標(biāo)本或者更換標(biāo)本采集部位后再次檢測。

       三. 目前已有哪些可商用的新型冠狀病毒檢測試劑？

       截至目前，國家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)新冠病毒核酸檢測試劑11個，抗體檢測試劑8個（如圖4）需要注意的是，正常情況下一種檢測試劑在臨床應(yīng)用之前都需要進(jìn)行性能驗證，以確保檢測試劑的性能可以滿足臨床需要，但疫情突發(fā)，已獲批的所有新型冠狀病毒檢測試劑都是屬于應(yīng)急審批，所有的檢測試劑產(chǎn)品都未經(jīng)過充分的性能驗證。即便如此，通過應(yīng)急審批的檢驗試劑也很大程度地滿足了國內(nèi)新型冠狀病毒肺炎診斷的需求。此外，在保障我國病毒檢測需要的基礎(chǔ)上，已有越來越多的國產(chǎn)冠狀病毒檢測試劑獲得歐盟認(rèn)證或經(jīng)NGO機構(gòu)進(jìn)行捐贈，馳援全球。

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       [7]澎拜新聞. 首先質(zhì)量要過關(guān)！首個新冠病毒檢測試劑盒誕生全程復(fù)盤. 來源：https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_5754281

       [8]第一財經(jīng). 共擊疫情，中國新冠病毒檢測試劑盒馳援全球.來源：https://www.yicai.com/news/100561666.html

       （注：原文有刪減）