CD47為慢病毒載體披上隱形衣或助肝靶向基因療法逃脫先天免疫

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來(lái)源：醫(yī)麥客

2019-05-27

在一些血友病基因療法中，腺相關(guān)病毒(AAV)作為載體來(lái)遞送表達(dá)功能凝血因子的基因。這種方法的一個(gè)局限性是，大多數(shù)人已經(jīng)對(duì)AAV產(chǎn)生了自然免疫，這可能使治療無(wú)效。

近日，由意大利米蘭San Raffaele Telethon基因治療研究所的科學(xué)家們領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)小組發(fā)現(xiàn)了一種可能的方法：通過欺騙免疫系統(tǒng)來(lái)改善血友病基因療法的遞送。

他們利用天然抑制劑CD47整合到慢病毒載體(LVs)的表面，抵消吞噬細(xì)胞對(duì)它們的捕獲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率更高，急性炎癥反應(yīng)的激活減少；在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(NHPs)的實(shí)驗(yàn)中，LVs能夠在不引起**的情況下將治療基因轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞——體內(nèi)凝血因子合成的主要場(chǎng)所。這項(xiàng)研究于5月22日發(fā)表在Science Translational Medicine雜志上。

遞送血友病基因療法，慢病毒載體具有潛力

針對(duì)遺傳性凝血障礙血友病的肝靶向基因治療是基因治療最成功的應(yīng)用之一。目前，重組凝血因子VIII或IX(FIX)蛋白替代治療(PRT)分別是A型血友病和B型血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療。然而，基因治療可能會(huì)在一次給藥后建立一個(gè)穩(wěn)定的組織功能因子來(lái)源，從而避免終生頻繁靜脈注射PRT的要求，并有可能提供對(duì)該病的徹底治愈。

單次靜脈注射重組腺相關(guān)病毒(AAV)衍生載體，將凝血因子基因的功能副本運(yùn)送至肝臟(凝血因子基因的天然生產(chǎn)部位)，已顯示出對(duì)血友病患者的安全性和有效性，并有望成為臨床可用的治療選擇。

然而，由于AAV載體不能主動(dòng)整合到宿主細(xì)胞基因組中，并且抗AAV免疫反應(yīng)限制了載體的重新整合，這類基因治療可能難以應(yīng)用于兒童患者。此外，相當(dāng)一部分成年患者對(duì)AAV預(yù)先免疫；因此，他們由于具有中和的抗AAV抗體(Abs)而沒有資格接受AAV載體給藥，或者由于對(duì)AAV衣殼的細(xì)胞免疫，需要免疫抑制一段時(shí)間來(lái)維持AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞。

在I/II期研究中，基因療法先驅(qū)Spark Therapeutics的SPK-8011用于治療A型血友病，使得12名患者的年出血率和輸血需求均下降了97%。然而，值得注意的是，Spark試驗(yàn)中劑量的2名患者(即進(jìn)入III期試驗(yàn)的劑量)出現(xiàn)了免疫反應(yīng)，導(dǎo)致他們的因子水平降至正常水平的5%以下。

和AAV一樣，慢病毒(LV)也被用于基因治療。Bluebird Bio的LentiGlobin，旨在治療另外的血液疾病 - β地中海貧血癥和嚴(yán)重的鐮狀細(xì)胞病，使用LV將人類β-珠蛋白基因的功能性版本插入患者的造血干細(xì)胞中。

LV由HIV衍生而來(lái)，它不像AAV那么流行，因此應(yīng)該是更好的基因治療遞送載體選擇。研究者認(rèn)為，隨著時(shí)間的推移，AAV療法的療效似乎在減弱，而這正是LV可能擁有的另一種優(yōu)勢(shì)。因?yàn)長(zhǎng)Vs能積極地整合到宿主細(xì)胞基因組中，并在細(xì)胞分裂時(shí)得以維持，如果不與插入突變的顯著風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這對(duì)于建立長(zhǎng)期表達(dá)具有潛在優(yōu)勢(shì)。

CD47 - 別吃我信號(hào)

然而，意大利的研究人員注意到，在發(fā)揮治療作用之前，LV可以被肝和脾的吞噬細(xì)胞(吞噬外來(lái)分子的白細(xì)胞)清除。

眾所周知，CD47蛋白是一種抑制巨噬細(xì)胞吞噬的信號(hào)分子，信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRP-α)的特異性配體。

因此，圣拉斐爾Telethon基因治療研究所的科學(xué)主任Luigi Naldini和同事們假設(shè)，將CD47連接到LV可以幫助基因療法逃離巨噬細(xì)胞的“魔爪”。

整合CD47到慢病毒，逃避免疫從而提高效率

研究通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)CD47，構(gòu)建了先前報(bào)道中的LV穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系和293T細(xì)胞，用于LV生產(chǎn)。為此，研究人員用CD47表達(dá)的自失活γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(SIN RVs)轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。

在293T細(xì)胞和LV生產(chǎn)細(xì)胞系(CD47hi細(xì)胞)的細(xì)胞表面上實(shí)現(xiàn)了CD47蛋白穩(wěn)定10至30倍的過表達(dá)。由CD47hi細(xì)胞產(chǎn)生的LV在對(duì)照293T細(xì)胞上具有與親本細(xì)胞產(chǎn)生的載體相當(dāng)?shù)牡味群透腥拘裕⑶彝ㄟ^電子顯微鏡顯示CD47的免疫染色顯著增加(P<0.0001)。

LV表面上CD47的量不影響包膜蛋白- 水泡性口炎病毒蛋白G(VSV.G)的存在，與CD47hi LV的未改變的感染性一致。當(dāng)CD47hi和對(duì)照LV與巨噬細(xì)胞系或原代人巨噬細(xì)胞一起孵育時(shí)，發(fā)現(xiàn)CD47hi LV的攝取顯著降低(P=0.0303)，其達(dá)到對(duì)照293T細(xì)胞中觀察到的基礎(chǔ)水平。相反，人巨噬細(xì)胞對(duì)無(wú)CD47LV的攝取顯著高于對(duì)照LV(P=0.0083)。

這些數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)LV顆粒上CD47的量可以影響人巨噬細(xì)胞對(duì)它們的攝取。

在NOD小鼠的體內(nèi)研究中，CD47hi LV表現(xiàn)出對(duì)吞噬作用和先天免疫激活的易感性降低；活體成像顯示，CD47調(diào)節(jié)KCs(庫(kù)弗氏細(xì)胞)對(duì)LV吞噬作用的速率和程度。

NHPs是最接近人類的模型，和人類之間SIRP-α和CD47的序列同源性分別為94%和99%。因此，下一步研究選擇恒河猴作為受試者，因?yàn)榕c其他NHP物種相比，對(duì)HIV感染的限制較低。

他們證明，LVs向NHP的體內(nèi)施用(靜脈注射)是安全且耐受良好的，并且表明CD47hi LV對(duì)先天免疫系統(tǒng)的活化減少，并且進(jìn)一步增加肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移。

盡管全基因組LV整合必然意味著對(duì)延遲的腫瘤發(fā)生的擔(dān)憂，但該研究結(jié)果顯示在NHP中沒有LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞或肝腫瘤擴(kuò)張的跡象，盡管存在治療個(gè)體數(shù)量和觀察時(shí)間的固有限制。NHP肝臟和脾臟中的LV IS分析顯示出不同的組成，幾乎所有獨(dú)特的IS由1-4個(gè)基因組代表，表明沒有發(fā)生克隆擴(kuò)增，并且與處理的NHP中大多數(shù)肝細(xì)胞預(yù)期的低至無(wú)增殖率一致。

此外，迄今為止，在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞(HSCs)或T細(xì)胞治療的數(shù)百名患者中，沒有任何關(guān)于插入性腫瘤發(fā)生的證據(jù)，這包括對(duì)最早接受治療的患者隨訪10年以上。鑒于HSC對(duì)致癌轉(zhuǎn)化的敏感性可能高于肝細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)令人放心，并支持LV設(shè)計(jì)、IS選擇和多克隆重建都有助于減輕這種風(fēng)險(xiǎn)的說(shuō)法。

研究小組補(bǔ)充說(shuō)，整合CD47可以降低所需的LV劑量，從而緩解制造需求，并降低副作用的可能性。

參考出處：

https://www.fiercebiotech.com/research/improving-viral-vectors-for-hemophilia-gene-therapies-by-tricking-immune-system

https://stm.sciencemag.org/content/11/493/eaav7325

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