CRISPR實(shí)現(xiàn)快速診斷疾病，這是基因編輯的小眾賽道

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2019-03-29

基因編輯技術(shù)CRISPR已經(jīng)催生了一些旨在使用該工具開(kāi)發(fā)新療法的初創(chuàng)公司，現(xiàn)在介紹的是該技術(shù)應(yīng)用的另一個(gè)不太擁擠的賽道——診斷測(cè)試。

美國(guó)加利福尼亞的一個(gè)學(xué)術(shù)研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)包括加州大學(xué)伯克利分校、Keck Graduate研究院、斯克里普斯學(xué)院、克萊蒙特麥肯納學(xué)院的研究人員，以及兩家生物技術(shù)初創(chuàng)公司Cardea Biosciences和Nanosens Innovations。

關(guān)于CRISPR-Chip的研究成果已經(jīng)發(fā)表于3月25日的《Nature Biomedical Engineering》上，進(jìn)一步證明了CRISPR-Cas技術(shù)在診斷領(lǐng)域的實(shí)用性。研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于石墨烯的新型手持設(shè)備，名為“CRISPR-Chip”，無(wú)需擴(kuò)增或測(cè)序，就可以從患者的DNA樣本中進(jìn)行特定的基因突變數(shù)字檢測(cè)。

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更方便、更簡(jiǎn)單、更快速的疾病檢測(cè)方式

大多數(shù)檢測(cè)核酸的方法需要許多試劑和昂貴的設(shè)備。而該手持裝置利用CRISPR的基因靶向能力，將一種部分失活的Cas9蛋白，與特異性的單鏈guild RNA復(fù)合并連接到基于石墨烯的晶體管上，實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)功能。

“我們與合作伙伴一起開(kāi)發(fā)了第一個(gè)使用CRISPR搜索基因組以尋找潛在突變的設(shè)備。”加州大學(xué)伯克利分校生物工程系助理教授、Keck Graduate研究院的Kiana Aran博士說(shuō)：“你只需將純化的DNA樣品放在芯片上，讓CRISPR進(jìn)行搜索，石墨烯晶體管在15分鐘內(nèi)就可以報(bào)告這次搜索的結(jié)果。”

CRISPR-Chip原型在石墨烯晶體管上覆蓋了數(shù)千個(gè)CRISPR-Cas復(fù)合體，這些蛋白會(huì)在DNA中找到特定位點(diǎn)結(jié)合，但是不會(huì)剪切。如果CRISPR-Cas分子未能檢測(cè)到樣品中的靶基因，則DNA將被釋放而不會(huì)結(jié)合。然而，當(dāng)發(fā)現(xiàn)完美的序列匹配時(shí)，蛋白與其結(jié)合并觸發(fā)石墨烯的表面產(chǎn)生額外的電荷。石墨烯晶體管的導(dǎo)電率發(fā)生變化，由CRISPR-Chip檢測(cè)并且作為電信號(hào)讀出。

在論文中，Aran的團(tuán)隊(duì)使用CRISPR-Chip分析從表達(dá)藍(lán)色熒光蛋白bfp基因的HEK293T細(xì)胞系收集的DNA樣本，這是一種常用于驗(yàn)證CRISPR-Cas基因編輯的基因。他們還檢測(cè)了由抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因突變引起的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）患者的臨床樣本。雖然突變可以在基因的所有79個(gè)外顯子中發(fā)生，但最常見(jiàn)的缺失發(fā)生在外顯子2-10和外顯子45-55。該團(tuán)隊(duì)使用CRISPR-Chip檢測(cè)這些常見(jiàn)缺失外顯子中的兩個(gè)（外顯子3或外顯子51）的突變，能夠在沒(méi)有任何預(yù)擴(kuò)增的情況下特異性地檢測(cè)缺失。

“我們只需要大約1/10的頰部拭子DNA。”Aran說(shuō)，“這項(xiàng)技術(shù)非常令人興奮，因?yàn)槲覀冋谔^(guò)通常需要在這些DNA樣本上進(jìn)行的大部分實(shí)驗(yàn)室的處理程序。”所需的硬件大小與大型手機(jī)相當(dāng)，可以在筆記本電腦上運(yùn)行，移動(dòng)性非常強(qiáng)。

“設(shè)備的靈敏度為每微升3.3納克。”Aran說(shuō)，“當(dāng)然，不同個(gè)體診斷測(cè)試的敏感性和特異性需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)量，我們還沒(méi)有進(jìn)行到這一步工作。”

這個(gè)平臺(tái)“非常聰明”，亞利桑那州立大學(xué)生物設(shè)計(jì)研究所單分子生物物理中心主任Stuart Lindsay評(píng)論說(shuō)，他沒(méi)有參與這項(xiàng)研究。“這里的新穎之處在于使用CRISPR進(jìn)行基因組檢索。通過(guò)化學(xué)物質(zhì)上DNA雜交來(lái)檢測(cè)靶基因是非常容易和相當(dāng)常規(guī)的，比如這里使用的石墨烯這種化學(xué)物質(zhì)。但是CRISPR的搜索功能允許它通過(guò)基因組尋找目標(biāo)靶，這就是為什么使用未擴(kuò)增的DNA也可以實(shí)現(xiàn)。“

另外也有DNA分子電子學(xué)專家認(rèn)為，該文章的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)較少，這使人懷疑結(jié)果是否可以重現(xiàn)。但是，Cardea首席技術(shù)官兼該研究的共同作者Brett Goldsmith博士斷言，“測(cè)試數(shù)據(jù)是我從納米電子傳感器中看到的和最可重復(fù)的數(shù)據(jù)之一。”

Goldsmith指出，“其他技術(shù)需要將DNA擴(kuò)增，任何DNA擴(kuò)增過(guò)程都會(huì)帶來(lái)相同的背景干擾問(wèn)題。很少有人能做到在不擴(kuò)增的情況下檢測(cè)DNA。“PCR擴(kuò)增DNA只能在絕對(duì)必要的時(shí)候使用，因?yàn)樵谘芯繉?shí)驗(yàn)室之外使用擴(kuò)增會(huì)有很多實(shí)際問(wèn)題。

未來(lái)，該裝置進(jìn)入臨床試驗(yàn)后，可用于快速診斷疾病，通過(guò)快速基因檢測(cè)幫助醫(yī)生為患者制定個(gè)性化的治療計(jì)劃。同時(shí)，也可以在實(shí)驗(yàn)室中用于監(jiān)測(cè)CRISPR是否與特定DNA序列結(jié)合，評(píng)估基于CRISPR的基因編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性。據(jù)Aran稱，該實(shí)驗(yàn)室將在今年準(zhǔn)備就緒，開(kāi)始使用Cardea生產(chǎn)設(shè)備并與Keck Graduate研究院一起使用，但是要想進(jìn)入臨床試驗(yàn)還有很復(fù)雜的程序。

CRISPR技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)公司已有兩家

加州大學(xué)伯克利分校的CRISPR早期技術(shù)專家Jennifer A. Doudna，在2017年創(chuàng)立了Mammoth Biosciences。該公司擁有加州大學(xué)的技術(shù)許可，利用CRISPR技術(shù)完成傳染病、腫瘤學(xué)和基因突變方面的快速診斷。而就在今年3月22日，張鋒參與組建的Sherlock Biosciences公司剛剛成立，并獲得了3500萬(wàn)的融資。該公司通過(guò)博德研究所獲得授權(quán)，也是基于CRISPR技術(shù)完成快速診斷。

眾多科學(xué)家正在參與CRISPR-Cas在診斷領(lǐng)域的發(fā)展，解決諸多難題。很多疾病、基因突變測(cè)試獲得結(jié)果可能需要很長(zhǎng)時(shí)間，而且在發(fā)展中國(guó)家等低資源環(huán)境下可能無(wú)法進(jìn)行測(cè)試。如果科學(xué)家能夠開(kāi)發(fā)新的診斷測(cè)試技術(shù)，可以顯著降低成本，提高便捷性，擴(kuò)大可及性，讓醫(yī)療不可能三角的難題得以解決。

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