8對(duì)手性片段大鬧蛋白組

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來(lái)源：美中藥源

2019-03-11

新聞事件

最近化學(xué)生物學(xué)大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細(xì)胞水平、蛋白組范圍為多個(gè)蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對(duì)互為對(duì)映體的小分子片段作為探針、設(shè)計(jì)了16個(gè)（8對(duì)對(duì)映體）所謂完全功能化片段（FFF）。這些FFF由三部分組成，除了與蛋白結(jié)合的探針片段外、還有一個(gè)在紫外光照下可以與蛋白質(zhì)反應(yīng)的雙***和一個(gè)可以與疊氮在生物環(huán)境下高效反應(yīng)的炔基。分子片段與蛋白結(jié)合后增加這些蛋白被雙***降解后形成卡賓捕捉的幾率，被捕捉蛋白再通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)被撈出，然后通過(guò)熒光或質(zhì)譜鑒定是哪些蛋白沒(méi)能抵制住FFF的誘惑。

作者用這些FFF在PBMC和HEK293兩種細(xì)胞中釣魚(yú)，找到176個(gè)能與至少一個(gè)小分子片段結(jié)合的蛋白。這些找到新配體的蛋白有些有已知的小分子配體，作者證明這些已知配體（通常是活性腔配體）可以與這些片段競(jìng)爭(zhēng)，說(shuō)明這些片段并非與功能無(wú)關(guān)的結(jié)合腔結(jié)合。因?yàn)檫@些FFF與蛋白形成了共價(jià)結(jié)合物，所以分析FFF接在降解后蛋白的哪個(gè)多肽上也可以佐證結(jié)合腔。作者只用了8對(duì)對(duì)映體就為176個(gè)蛋白找到心儀配體，如果擴(kuò)大FFF范圍有望為多數(shù)蛋白找到小分子配體、也可以根據(jù)成功率定義某個(gè)特定蛋白的成藥性。

藥源解析

這個(gè)工作涉及新藥發(fā)現(xiàn)早期階段的幾個(gè)重要方面、其FFF設(shè)計(jì)和用到的分析技術(shù)也很巧妙，值得解讀一下。靶點(diǎn)的成藥性是新藥發(fā)現(xiàn)立項(xiàng)的一個(gè)關(guān)鍵考慮，如果事先知道一個(gè)靶點(diǎn)成藥性很差廠家則可以放棄在篩選上的過(guò)度投入、避免浪費(fèi)太多時(shí)間和資源。當(dāng)然有些與疾病高度相關(guān)、但成藥性差的靶點(diǎn)如KRAS制藥業(yè)明知山有虎偏向虎山行是另一回事，成藥性這個(gè)信息還是十分關(guān)鍵的。這個(gè)工作如果擴(kuò)展可能在蛋白組范圍為多數(shù)蛋白的成藥性分層。很多蛋白沒(méi)有已知小分子配體，為蛋白找到一個(gè)可以在細(xì)胞環(huán)境下結(jié)合的先導(dǎo)物是藥物優(yōu)化的第一步。在一定程度上這176個(gè)蛋白已經(jīng)有了苗頭化合物。

這個(gè)工作的基本思路早就有了，但是細(xì)節(jié)上作者做了重要改進(jìn)。分子片段因?yàn)楸容^小所以與任何蛋白結(jié)合都不會(huì)太強(qiáng)、選擇性也不會(huì)太好，作者定義的選擇性結(jié)合是兩個(gè)對(duì)映體捕捉的同一蛋白相差2.5倍以上。之所以比較對(duì)映體是因?yàn)榭ㄙe化學(xué)反應(yīng)活性極強(qiáng)、即使探針沒(méi)有與蛋白結(jié)合或者非特異結(jié)合也會(huì)通過(guò)隨機(jī)分子間碰撞捕捉住一些蛋白。而細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的表達(dá)量差很多，所以高表達(dá)蛋白按概率也會(huì)更多被捕捉。但因?yàn)榈鞍捉Y(jié)合腔通常是手性環(huán)境，所以對(duì)映體之間的差別可以作為排除非特異結(jié)合的一個(gè)指標(biāo)（如果兩個(gè)對(duì)映體捕捉同量蛋白說(shuō)明特異性結(jié)合沒(méi)有起到關(guān)鍵作用）。所以通過(guò)這個(gè)程序捕捉的蛋白并不一定是結(jié)合力最強(qiáng)的蛋白、也不一定是被捕捉量的蛋白，因?yàn)槿绻Y(jié)合腔不能區(qū)分探針手性無(wú)論結(jié)合力多強(qiáng)都會(huì)被當(dāng)作噪音（對(duì)映體之間無(wú)差別）被去掉。這是這個(gè)工作設(shè)計(jì)上的一個(gè)重要改進(jìn)。

通常一個(gè)靶點(diǎn)要找到有用的小分子配體都得篩選上百萬(wàn)的化合物庫(kù)，他們?cè)趺粗挥?6個(gè)片段就篩選了整個(gè)蛋白組、并為176個(gè)蛋白找到了配體了呢？當(dāng)然原因是探針濃度的慷慨和結(jié)合強(qiáng)度的容忍。探針濃度在20-200 uM之間，而因?yàn)楹Y選的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是化學(xué)反應(yīng)速率較小的差別（2.5倍）、所以對(duì)結(jié)合強(qiáng)度要求可能非常低。另外捕捉蛋白量的不同也可能是對(duì)映體結(jié)合力相同但卡賓與蛋白C-H的插入反應(yīng)速率有差別，但作者認(rèn)為這也是個(gè)有用信息。即使如此作者只用8對(duì)對(duì)映體就捕捉了176個(gè)蛋白還是很高效，尤其考慮到80%的蛋白只與一個(gè)探針結(jié)合，說(shuō)明結(jié)合有一定選擇性。這些探針都是結(jié)構(gòu)比較相似的氨基取代芳香化合物，是GPCR受體的所謂優(yōu)勢(shì)骨架，但這176個(gè)蛋白中GPCR并不多。很多與這些化合物結(jié)合的蛋白是酶，但也有一些比較難成藥的蛋白如轉(zhuǎn)錄因子。

除了設(shè)計(jì)這個(gè)工作中用的一些技術(shù)也很巧妙。多數(shù)能令蛋白C-H鍵參與的化學(xué)反應(yīng)都需要酸堿催化、或高溫、或需要有機(jī)溶劑，在pH7室溫水溶液中能與天然蛋白加成的反應(yīng)半只手就能數(shù)過(guò)來(lái)。打撈被捕捉蛋白的點(diǎn)擊反應(yīng)知道的人很多，但不一定有很多人理解Sharpless從茫茫人海中找到這個(gè)不起眼的古老化學(xué)反應(yīng)需要的功力。從看著就像千里馬的馬中找到千里馬容易，但從長(zhǎng)相普通的馬中找到千里馬要看手藝。因?yàn)椴蹲降鞍赘患壤挥袔妆?，所以?zhǔn)確分析很重要。他們把細(xì)胞分成兩份、分別用兩個(gè)對(duì)映體處理，但其中一份用同位素標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)。分析時(shí)把兩份細(xì)胞混合起來(lái)做高通量質(zhì)譜、這樣就知道哪個(gè)蛋白來(lái)自哪份細(xì)胞。同樣也可以用同位素標(biāo)記的甲醛衍生化捕捉蛋白，而另一個(gè)更高通量的分析方法準(zhǔn)確性也足夠可靠。

制藥工業(yè)中這個(gè)體系更經(jīng)常用于候選藥物在細(xì)胞內(nèi)與靶點(diǎn)的結(jié)合確證。在純化蛋白有活性的化合物需要有在細(xì)胞環(huán)境下與靶點(diǎn)蛋白相互作用的證據(jù)，否則會(huì)成為一個(gè)開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。這個(gè)數(shù)據(jù)雖然不一定必須要有，很多上市藥物當(dāng)年沒(méi)有這個(gè)數(shù)據(jù)。但靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)類似探險(xiǎn)的地圖，雖然沒(méi)有地圖你也可能找到寶藏并安全返回、但犧牲在路上的風(fēng)險(xiǎn)大增。

找到一個(gè)能與蛋白結(jié)合的探針只是萬(wàn)里長(zhǎng)征第一步。這樣小的配體要優(yōu)化成可以作為藥物使用的分子需要很長(zhǎng)時(shí)間，通常需要有蛋白晶體結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)、否則難度太大。足夠活性的化合物找到后可能在動(dòng)物模型中無(wú)法重復(fù)基因?qū)W研究結(jié)果、或者**太大。即使一切順利進(jìn)入臨床也只有5-10%的可能上市、有1-2%的可能成為公司可以依賴的大產(chǎn)品。這個(gè)工作雖然非常出色，但只相當(dāng)于登山從大本營(yíng)出發(fā)、與登頂還相隔無(wú)數(shù)磨難。藥物發(fā)現(xiàn)就是這么難。

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