開始做這個(gè)項(xiàng)目時(shí)，我的預(yù)期是2020年能做出來就很不錯(cuò)了。” 中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（以下簡(jiǎn)稱“中科院神經(jīng)所”）所長(zhǎng)蒲慕明告訴科技日?qǐng)?bào)記者。
中科院神經(jīng)所研究員孫強(qiáng)從蒲慕明那接到體細(xì)胞克隆猴任務(wù)時(shí)，給自己和團(tuán)隊(duì)的時(shí)間是十年。事實(shí)上，他們僅用了五年就做出讓學(xué)術(shù)界矚目的成果。
2017年11月27日，世界上首只體細(xì)胞克隆猴“中中”在中科院神經(jīng)所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心的非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)誕生；同年12月5日，第二只克隆猴“華華”誕生。這一成果標(biāo)志著中國(guó)率先開啟了以體細(xì)胞克隆猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的新時(shí)代。
今年1月份，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與同屬于中科院神經(jīng)所的張洪鈞團(tuán)隊(duì)合作，再獲佳績(jī)：在張洪鈞團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型的基礎(chǔ)上，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)通過一只癥狀最明顯的公猴的體細(xì)胞克隆出五只小猴。這項(xiàng)進(jìn)展說明中國(guó)科學(xué)家已可以批量生產(chǎn)遺傳背景均一的疾病獼猴模型。
夢(mèng)寐以求多年但無法達(dá)成的目標(biāo)
遺傳背景單一的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型是科研人員夢(mèng)寐以求多年但無法達(dá)成的目標(biāo)。
“用小鼠做藥效檢測(cè)，可以剔除遺傳背景因素，更好地觀察藥效。”蒲慕明說。但是，由于小鼠的基因、代謝和腦組織結(jié)構(gòu)和生理等方面與人類差別太大，部分藥物作用在人類和小鼠上的效果也差別巨大，相比之下，與人類基因更接近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物顯然是更好的動(dòng)物模型。
非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物首選對(duì)象肯定是猴子?？墒且吧锏倪z傳背景各異、個(gè)體表征差異難統(tǒng)一，每次科學(xué)實(shí)驗(yàn)或藥物檢測(cè)的對(duì)照驗(yàn)證，需要使用大量實(shí)驗(yàn)猴，而且野生猴繁殖周期長(zhǎng)、單胎數(shù)量少，驗(yàn)證工作常常持續(xù)很多年，時(shí)間過于漫長(zhǎng)。所以想將其作為動(dòng)物模型，的難題就是如何獲得遺傳背景相同的猴子。
“小鼠繁殖很快，自然繁殖幾代后它們的遺傳背景就相同了。猴子繁殖一代就要五六年，所以唯一的辦法就是克隆。”蒲慕明說。
但克隆猴太難了。美國(guó)、中國(guó)、德國(guó)、日本、新加坡和韓國(guó)等世界科研機(jī)構(gòu)都在攻關(guān)非人靈長(zhǎng)類體細(xì)胞克隆，均未成功。此前，體細(xì)胞克隆猴最接近成功的一次是在2010年，美國(guó)俄勒岡靈長(zhǎng)類研究中心在給代孕猴媽媽胚胎移植后的第81天發(fā)生流產(chǎn)。“只有獲得遺傳背景相同的克隆猴，才能程度發(fā)揮平臺(tái)的作用，真正推進(jìn)相關(guān)藥物的研發(fā)。美國(guó)科學(xué)家還差一半就成功了。我們也很有希望成功，但要做好剩下的一半。”蒲慕明說。
超高實(shí)驗(yàn)技巧完成艱難的“另一半”
剩下的“另一半”卻遠(yuǎn)比想象艱難許多。
孫強(qiáng)分析，在體細(xì)胞克隆猴技術(shù)具體操作上，主要有兩大難點(diǎn)。第一點(diǎn)，“拿掉細(xì)胞核的時(shí)候不能抽掉周圍太多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，否則細(xì)胞就不發(fā)育了”。此外，移植到卵細(xì)胞中的，是成熟的、只表達(dá)某些特定基因的體細(xì)胞細(xì)胞核，研究人員需要想辦法讓它重新變成一個(gè)未分化的全能胚胎細(xì)胞。
孫強(qiáng)解釋道，由于猴子細(xì)胞不透明，在顯微鏡下看不到細(xì)胞核，需要通過偏振光才能把細(xì)胞核顯示出來。在孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)的研究記錄視頻中，研究人員注視著顯微鏡，在一閃一閃的偏振光下，操縱10微米左右直徑的極細(xì)針頭在細(xì)胞里吸取、注射，并盡可能減小對(duì)細(xì)胞的損傷，其難度遠(yuǎn)大于操縱繡花針。
除了去核要求速度快外，將體細(xì)胞核注入去核卵細(xì)胞同樣要求非常快，“我們的團(tuán)隊(duì)成員可以做到15秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對(duì)卵細(xì)胞損傷最小。”孫強(qiáng)說。
第二點(diǎn)，在核基因組啟動(dòng)前，體細(xì)胞核要經(jīng)歷一個(gè)回復(fù)到早期胚胎核狀態(tài)的過程，也就是重編程。只有將這個(gè)過程控制好，才能提高體細(xì)胞胚胎的發(fā)育率。在嘗試各種調(diào)控方法效果均不理想后，2014年，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在一篇報(bào)道中看到一種新的酶處理方法，并最終用這一方法將囊胚率提升到45%，優(yōu)質(zhì)胚胎率升高到29%。最終，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)用127枚卵母細(xì)胞，做了109個(gè)重構(gòu)胚胎，對(duì)21只猴子受體進(jìn)行移植，獲得6只懷孕受體，最后只有兩只在2017年順利出生。
“這個(gè)工作證實(shí)了獼猴可以用體細(xì)胞來克隆，并且，它可以成為有用的動(dòng)物模型。”蒲慕明認(rèn)為。
將構(gòu)建足夠數(shù)量的疾病模型猴
短短一年后，中科院神經(jīng)所科研團(tuán)隊(duì)再次用體細(xì)胞克隆技術(shù)生成了5只遺傳背景相同的模型猴——世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型。記者在中科院神經(jīng)所非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)看到，一只半歲多的猴子，躲在孵育箱角落里。它就是神經(jīng)所科研團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的世界首例生物節(jié)律紊亂猴克隆后代之一。
生物節(jié)律的基礎(chǔ)研究與轉(zhuǎn)化干預(yù)目前亟須好的生物模型。2016年9月，張洪鈞團(tuán)隊(duì)首次利用基因修飾方法，得到一批生物節(jié)律核心基因BMAL1缺失的獼猴。
然而，通過基因敲除方法獲得的第一代模型猴，容易產(chǎn)生嵌合體，這成了研究的阻礙。由于這一批猴的生物節(jié)律紊亂嚴(yán)重程度不一致，無法作為理想的動(dòng)物模型。隨著“中中”“華華”的誕生，研究人員開始思考，能否利用克隆猴技術(shù)，構(gòu)建出疾病模型猴？
孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)馬不停蹄，在國(guó)際上首次獲得5只遺傳背景一致的生物節(jié)律紊亂克隆猴。
“這個(gè)成果比首例體細(xì)胞克隆猴更進(jìn)一步的地方在于，上次用的是流產(chǎn)胚胎的體細(xì)胞，這次用的是活猴的體細(xì)胞來克隆的，可以在兩代猴之間進(jìn)行比對(duì)。”蒲慕明說，更重要的是，此次克隆的是一種有疾病表型的猴，這首次證實(shí)通過體細(xì)胞核移植技術(shù)可以克隆成年基因修飾猴，進(jìn)一步表明克隆猴作為疾病模型的有效性。
“這些腦疾病模型克隆猴，未來將有助于解析腦重大疾病的致病機(jī)理、確立預(yù)警和早期診斷指標(biāo)、進(jìn)行干預(yù)和治療等。建立基于疾病模型猴的非人靈長(zhǎng)類平臺(tái)，將成為中國(guó)腦計(jì)劃的一大亮點(diǎn)。”蒲慕明表示。
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