嵌合抗原受體（CAR）是一類工程化的細胞表面受體，一般表達在T細胞上，介導(dǎo)工程化T細胞針對特定靶點腫瘤細胞的殺傷。其中針對CD19（一種B細胞表面標(biāo)記蛋白）的兩款CAR-T細胞療法Kymriah（諾華）和Yescarta（吉利德）已經(jīng)于2017年獲得了FDA的批準，開創(chuàng)了CAR-T細胞療法的元年。
縱觀CAR-T的發(fā)展史，第一代CAR-T只有CD3ζ鏈（ITAM，Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs）；第二代CAR-T添加了CD28或4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域（CM1），比如Kymriah和Yescarta；第三代CAR-T同時添加了CD28和4-1BB等兩個共刺激結(jié)構(gòu)域（CM1和CM2）；第四代CAR-T在第二代的基礎(chǔ)上添加了共表達的細胞因子，比如IL-12等；第五代CAR-T同樣基于第二代，添加了激活其它信號通路的共刺激結(jié)構(gòu)域，比如IL2-2Rβ胞內(nèi)結(jié)合SAAT3/5的結(jié)構(gòu)域。這一代又一代各種不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計，賦予了CAR-T細胞療法無限的生機和未來（圖1）。
圖1：CAR-T細胞結(jié)構(gòu)設(shè)計發(fā)展歷程
上述5代不同設(shè)計的CAR-T，雖然都是工程化組合不同信號分子結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，但仍局限在直接利用原始結(jié)構(gòu)域的范疇內(nèi)。比如使用CD3ζ鏈信號傳導(dǎo)基序的天然序列（包含3個ITAM），或者使用CD28、4-1BB的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的原始序列，對結(jié)構(gòu)域本身并未做任何工程化改造。特別是CAR設(shè)計中最重要的CD3ζ結(jié)構(gòu)域，幾乎全都是包含3個ITAM結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)全長序列。然而近日紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain及其團隊在Nature Medicine上發(fā)表的一篇重磅研究指出使用CD3ζ鏈中的1個ITAM結(jié)構(gòu)域的而不是全長，可以獲得更強的腫瘤抑制活性，該研究或?qū)㈤_啟未來CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計的全新思路。
Michel Sadelain及其團隊針對使用CD28-CD3ζ的CAR-T細胞較容易出現(xiàn)T細胞耗竭的現(xiàn)象，提出假設(shè)認為這可能是由于CD3ζ包含的3個ITAM結(jié)構(gòu)域過度激活T細胞導(dǎo)致的。因此他們基于CD19-CD28-CD3ζ的經(jīng)典CAR-T結(jié)構(gòu)，設(shè)計了3種突變型CD3ζ結(jié)構(gòu)域，分別突變失活了1個或2個ITAM結(jié)構(gòu)域（圖2）。結(jié)果在小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)只有ITAM-1結(jié)構(gòu)域有活性的CAR-T細胞（1XX）體內(nèi)抗腫瘤活性反而更強，并且具有更長的持久力；而保留ITAM-3結(jié)構(gòu)域活性的CAR-T細胞（XX3）抗腫瘤活性最差（圖3）。
圖2：不同CD3ζ突變的CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)，通過點突變技術(shù)廢除了ITAM結(jié)構(gòu)域的活性
圖3：小鼠腫瘤模型評價CAR-T細胞抑制腫瘤細胞的能力
基于上述實驗結(jié)果，研究者懷疑是不是由于ITAM-3結(jié)構(gòu)域本身傳導(dǎo)信號的能力較弱才導(dǎo)致只保留ITAM-3結(jié)構(gòu)域活性的CAR-T細胞效果最差呢？因此他們設(shè)計了只含有ITAM-1或ITAM-3的CAR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)?、比?jīng)典的CAR-T更強的抑制腫瘤的活性（圖4）。這些結(jié)果說明在CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)中，ITAM的數(shù)量和所處的位置對CAR-T細胞抑制腫瘤的能力具有重要的影響，越靠近跨膜區(qū)的ITAM傳導(dǎo)信號的能力越強。
圖4：截斷CD3ζ的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計和小鼠體內(nèi)腫瘤抑制能力的評價
在TCR信號傳導(dǎo)中，CD3ζ的激活基序ITAM發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。簡單來說，當(dāng)TCR-CD3與MHC-peptide結(jié)合后，一個叫做Lck的酪氨酸激酶磷酸化CD3ζ的ITAM結(jié)構(gòu)域，磷酸化的ITAM招募并結(jié)合ZAP-70蛋白，招募的ZAP-70同樣被Lck磷酸化并和Lck一起磷酸化其它的蛋白從而傳導(dǎo)T細胞激活信號（圖5）。
圖5：TCR-CD3信號通路主要相關(guān)蛋白
在T細胞的天然激活過程中，CD3ζ的3個ITAM都是不可或缺的，但是為什么在CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)的CAR-T細胞中只有一個ITAM反而會產(chǎn)生更強的腫瘤抑制活性呢？ Michel Sadelain等通過全基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄圖譜分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)典結(jié)構(gòu)的CAR-T細胞更接近效應(yīng)T細胞，1XX結(jié)構(gòu)的CAR-T細胞更接近于記憶T細胞，而腫瘤抑制活性最差的XX3結(jié)構(gòu)CAR-T細胞更接近于初始T細胞（圖6）。所以在體內(nèi)，同時具備一定效應(yīng)T細胞和記憶T細胞能力的1XX結(jié)構(gòu)CAR-T細胞具有更持久的腫瘤抑制活性也就不奇怪了。
圖6：3種CAR-T細胞表型分析
最后筆者認為，在CD28作為共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR設(shè)計中，減少ITAM明顯具有更強的優(yōu)勢；然而在基于4-1BB作為共刺激結(jié)構(gòu)域的設(shè)計中，減少還是增加ITAM更有效果還需要實驗驗證。但最終的目標(biāo)都是找到一個最合適的T細胞激活程度，過多或過少都不能發(fā)揮最強的腫瘤抑制活性，基于該設(shè)計的臨床實驗也在進行中，我們期待將來會有不錯的數(shù)據(jù)公布。
參考文獻：
1. Calibration of CAR activation potential directs alternative T cell fates and therapeutic potency.
2. Selected signalling proteins recruited to the T cell receptor-CD3 complex.
3. Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.
筆者簡介：Harry，分子生物學(xué)方向碩士，腫瘤免疫療法從業(yè)人員，致力于為更好的腫瘤免疫療法貢獻一份力量。
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