CRISPR-Cas9基因編輯技術的有效運行依賴于Cas9酶在特定目標位點切割DNA。但是，這一技術卻面臨著“脫靶”的風險，即Cas9酶可能會在錯誤的位置剪切。我們都知道，編輯了“預想之外”的基因，很有可能會帶來不可預控的嚴重后果。
通常，我們檢測非靶標突變（off-target mutations）的方法是：先利用計算機算法預測出最可能被“錯誤擊中”的區(qū)域，然后再檢查這些“危險區(qū)域”的缺失和插入情況。
9月12日，《Nature》期刊最新發(fā)表一篇題為“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究，揭示了一種預測基因組編輯中“錯誤突變”的新策略，并在小鼠試驗中證實精心設計的引導RNA鏈不會產生任何可檢測到的錯誤突變。
“脫靶效應”有多嚴重
非靶向剪切可能發(fā)生在對生物功能沒有影響的基因組位置，也可能會破壞細胞的基本功能。通常，研究人員會利用計算機程序進行預測，但是這些預測依賴于引導RNA如何與DNA結合以及Cas9如何切割的假設。
2017年5月，《Nature Methods》期刊曾發(fā)表一篇文章，揭示CRISPR能夠引入數(shù)百種意想不到的突變。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPR確實能夠成功糾正引發(fā)失明的基因，但兩只接受了基因治療的小鼠的基因組中存在超過1500個單核苷酸突變以及超過100處更大片段的缺失和插入。需要強調的是，這些DNA突變都沒有被計算機算法預測出來。
雖然錯誤概率遠超我們的認知，但是我們依然缺乏一種能夠準確預測CRISPR非靶標編輯的方法，這意味著，目前我們還不清楚這些預測突變是否會發(fā)生以及發(fā)生的頻率如何。
最新研究：引導RNA 是關鍵
文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物學家Marcello Maresca表示，公司的一個長期目標是能夠使用基因編輯技術治療一些人類疾病。“然而，要想實現(xiàn)CRISPR藥物的潛力，就需要開發(fā)出一種方法，能夠讓目標基因得到有效修飾，且基因組其他位置不受影響。”
在這項新研究中，Maresca團隊與哈佛大學和麻省總醫(yī)院的生物學家、病理學家J. Keith Joung課題組合作，開發(fā)了一種“體內非靶點驗證”的方法（verification of in vivo off-targets，VIVO），可以穩(wěn)定地鑒定出CRISPR在體內全基因組中的脫靶效應。
首先，他們以小鼠基因組為研究對象，在體外將其DNA剪切成片段，每個片段約包含300個堿基對，然后連接一系列使DNA形成閉環(huán)的“接口”（adapters）。隨后，他們引入一個Cas9核酸酶和引導RNA復合體，它們會在環(huán)狀DNA的一些位點上進行切割，使其線性化。最后，研究人員會添加另一批核酸酶，負責降解剩余未被剪切的閉環(huán)DNA。
通過這一系列步驟，研究人員可以對線性化的DNA進行測序，以檢測Cas9在哪些位置進行了切割（無論是有意的還是無意的），同時預測引導RNA是否會在體內引發(fā)脫靶效應。
以上體外驗證工作是J. Keith Joung團隊于2017年完成的工作（發(fā)表在《Nature Methods》期刊）。現(xiàn)在，他們將成果轉移至體內：利用一引導RNA（在體外預測中，發(fā)現(xiàn)其會在基因組中造成數(shù)千個錯誤剪切位點）進行小鼠體內試驗。結果顯示，超40%的預測位點在小鼠肝 臟中確實發(fā)生了突變。
而且，在體外預測中，一個位點出現(xiàn)的頻率越高，它在體內發(fā)生突變的可能性就越大。換句話說，引導RNA在體外是“粗心”的，在體內肯定也是粗心的。
研究團隊還檢測了小鼠體內試驗中基因組上的特殊位點——這些點在計算機預測中都屬于可能的脫靶位點，但是在體外試驗中并沒有出現(xiàn)——結果發(fā)現(xiàn)，在體內試驗中這些位點并沒有出現(xiàn)突變。這意味著，體外試驗并沒有錯過真正的非目標剪切。
更重要的是，他們證實，設計對靶點高度特異性的引導RNA，可以有效指導小鼠肝 臟細胞的基因編輯，且不會出現(xiàn)可檢測到的非靶向突變。
這項研究證實“你確保有一個真正準確的引導RNA”，多倫多大學的發(fā)育生物學家Janet Rossant表示，“這項研究的突破性在于，VIVO能夠檢測出細胞特定的非靶標突變，而不是依賴于參考基因組序列（不一定能夠反映你所研究的有機體的遺傳背景，或者在臨床應用中患者的遺傳背景）。由于可以針對來自于患者或者特定有機體的基因組DNA在體外進行篩選，因此測序步驟的讀取結果反映了受試者基因組中可能的Cas9目標。”
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