DOI: 10.1016/j.stemcr.2018.02.003
該研究利用視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）病人的100-300mL尿液樣本建立了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），并分化成病人特異的三維視網(wǎng)膜類(lèi)器官（3D retinal organoids），進(jìn)而在培養(yǎng)皿中成功模擬了疾病視網(wǎng)膜的纖毛病變和感光細(xì)胞喪失。運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)修復(fù)患者的基因突變后，發(fā)現(xiàn)在基因表達(dá)譜、蛋白水平及細(xì)胞電生理特性等方面能成功阻止了病變的發(fā)生。
RP是成年人中途失明的重要病因。雖然其致病基因多達(dá)85個(gè)，但僅僅RPGR一個(gè)基因的突變就導(dǎo)致了多達(dá)16%患者罹患此病。RPGR在感光細(xì)胞中主要存在于連接纖毛處，負(fù)責(zé)從內(nèi)節(jié)運(yùn)輸視蛋白至外節(jié)，以此產(chǎn)生光電反應(yīng)。以往研究該疾病主要使用基因突變小鼠和犬類(lèi)模型，但由于這些動(dòng)物跟人類(lèi)種屬不同，基因型表型間存在諸多差異，不能很好的詮釋人類(lèi)RPGR基因突變所造成的RP進(jìn)程；再者RP患者視網(wǎng)膜的標(biāo)本本身難以取得，這無(wú)疑給機(jī)制的研究造成了困難。針對(duì)以上難題，獲得病人特異性iPSCs，將其立體分化以此模擬病人自體視網(wǎng)膜的發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展，是研究此病機(jī)制和治療的途徑。
文中三個(gè)病人的iPSCs均重編程自尿液里脫落的細(xì)胞，安全無(wú)創(chuàng)的方法使病人依從性更佳。在正常分化三維視網(wǎng)膜中，長(zhǎng)達(dá)35周的培養(yǎng)使其具備延長(zhǎng)的視錐、視桿細(xì)胞外節(jié)，并擁有感光細(xì)胞特有的電生理特性。然而RPGR病人的3D視網(wǎng)膜視錐視桿細(xì)胞均顯著減少，且存活的視桿細(xì)胞中還存在大量異常形態(tài)并分布紊亂。RNAseq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)病人組感光細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量均顯著降低；膜片鉗數(shù)據(jù)也顯示，病人3D視網(wǎng)膜喪失了感光細(xì)胞的電生理特性；而且，纖毛長(zhǎng)度在病人的iPSCs、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞中都顯著變短。采用CRISPR/Cas9修復(fù)RPGR突變后，基因修復(fù)組分化的3D視網(wǎng)膜感光細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組、蛋白表達(dá)、電生理特性上都得到了挽救，纖毛長(zhǎng)度也恢復(fù)了正常。這從概念上對(duì)基因修復(fù)進(jìn)行了驗(yàn)證，修復(fù)致病基因RPGR的確可以治愈其引起的RP疾病。
基因修復(fù)的細(xì)胞能用作視網(wǎng)膜再生治療；雞盲眼視網(wǎng)膜類(lèi)器官可以促進(jìn)RP的新藥研發(fā)。據(jù)悉，該課題組已經(jīng)建立了較大規(guī)模的“夜盲癥”病人iPS細(xì)胞庫(kù)，今后將繼續(xù)擴(kuò)大疾病iPSC庫(kù)規(guī)模，并在細(xì)胞和分子水平致病機(jī)理挖掘、藥物篩選和新藥研發(fā)方面展開(kāi)更多的研究。
溫州醫(yī)科大學(xué)金子兵課題組的博士生鄧雯麗和助理研究員高美玲為本文共同第一作者，金子兵教授為通訊作者。參與此項(xiàng)研究工作的還有溫醫(yī)大雷新蘭（現(xiàn)單位：武漢大學(xué)人民醫(yī)院）、呂技能、何凱文、夏茜茜、陳煜晨、李艷萍、潘登，以及中國(guó)科技大學(xué)黎凌云博士生、趙歡副教授、薛天教授在膜片鉗實(shí)驗(yàn)方面的支持。本項(xiàng)目主要在國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金、科技部干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目、浙江省自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目、溫州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)等課題資助下完成。
致謝本文的模式圖繪制者碩士生金飔倩和陳珍姬。
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