背景：在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)，A型腦膜炎雙球菌是造成細(xì)菌性腦膜炎的主要原因。腦膜炎球菌是一種胞外多糖包被的病菌。針對(duì)該多糖產(chǎn)生的抗體可以起到的保護(hù)作用。純化多糖**對(duì)控制A型腦膜炎球菌引起的流行病僅具有較小成功率。而蛋白-多糖結(jié)合**對(duì)多種價(jià)態(tài)的病菌具有高效保護(hù)作用。方法：單價(jià)A型腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合**已被腦膜炎**項(xiàng)目（PATH和世界衛(wèi)生組織的合作關(guān)系）的科學(xué)家發(fā)明出來。結(jié)果：生物制品評(píng)價(jià)與研究中心的細(xì)菌多糖實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種高效結(jié)合方法。印度血清研究所進(jìn)一步發(fā)展該方法，利用純化的A型多糖和載體蛋白破傷風(fēng)類毒素生產(chǎn)現(xiàn)在應(yīng)用的高效A型多糖結(jié)合**。結(jié)論：雖然多年來，腦膜炎球菌多糖**在非洲腦膜炎球菌帶預(yù)防腦膜炎球菌流行病作用有限。但我們合作開發(fā)的A型結(jié)合**是一種安全高效的**。

       腦膜炎球菌是流行性病原，是造成成人、兒童細(xì)菌性腦膜炎的重要原因。關(guān)于腦膜炎球菌疾病對(duì)公共衛(wèi)生的威脅程度隨著時(shí)間及區(qū)域變化會(huì)發(fā)生較大變化。但每當(dāng)腦膜炎球菌疾病發(fā)生時(shí)，腦膜炎球菌的流行病潛力涉及特殊的公共衛(wèi)生安全。

       腦膜炎球菌基于化學(xué)成份及不同的胞外多糖被分為12種不同價(jià)態(tài)。幾乎所有的腦膜炎球菌疾病都是由A、B、C、X、Y和W型腦膜炎球菌造成的。不同價(jià)態(tài)的影響重要性隨地理區(qū)域發(fā)生變化。A型腦膜炎球菌在撒哈拉沙漠以南的非洲是最重要的腦膜炎疾病的因素，而在美國，一半的腦膜炎球菌疾病是由C、Y型引起的。在亞洲國家，80%的疾病由B型腦膜炎球菌引起。X型和W型在非洲造成較小或中等規(guī)模疾病爆發(fā)。

       人類是腦膜炎球菌唯一的自然宿主。5%-10%的成人是無癥狀腦膜炎球菌攜帶者。在引進(jìn)A型結(jié)合**前，數(shù)據(jù)顯示撒哈拉沙漠以南非洲A型腦膜炎球菌攜帶率小于1%。

       A型腦膜炎球菌結(jié)合**的必要性

       許多的非洲流行疾病與A型腦膜炎球菌有關(guān)。在過去的20年里，蒙古、尼泊爾、印度均報(bào)道過A型流行病爆發(fā)，但相較于撒哈拉沙漠以南的非洲程度較小。非洲“腦膜炎帶”面積巨大，從西部的塞內(nèi)加爾延伸到東部的埃塞俄比亞，有約4.5億人。非洲“腦膜炎帶”的概念是由Lapeyssonnie在1963年第一次提出。腦膜炎球菌流行病易發(fā)于炎熱、干燥、多灰的季節(jié)，一般是一月到五月，而雨季后立即停止。每年都會(huì)在多個(gè)國家集中發(fā)生流行病，而每8-12年會(huì)發(fā)生流行病大爆發(fā)。流行病的周期性反映了隨時(shí)間人口免疫性的巨大變化。

       在非洲主要流行病中，100-800人/每100000人（部分地區(qū)高達(dá)1%）是由A型腦膜炎球菌引起的。盡管投入了百萬劑量的A/C多糖**來應(yīng)對(duì)流行病爆發(fā)，但還是存在高比例的爆發(fā)。A型腦膜炎球菌流行病爆發(fā)經(jīng)常持續(xù)2個(gè)月以下，而相應(yīng)措施需要菌種鑒定、尋找**、獲得資金用于**購買和運(yùn)營費(fèi)用。以上過程都需要時(shí)間，相應(yīng)措施經(jīng)常滯后甚至在流行病爆發(fā)結(jié)束后。

       在1996年-1997年，西非遭遇了有史以來的腦膜炎流行病爆發(fā)，18萬感染案例，2萬人死亡。從1998年到2010年，WHO報(bào)道有70萬新增急性腦膜炎病例[8]。其中受影響最嚴(yán)重的國家包括布基納法索、尼日利亞、乍得、埃塞爾比亞。在2002年，爆發(fā)于以上國家的案例占整個(gè)非洲案例的65%。在2009年，尼日利亞報(bào)道7萬A型腦膜炎感染案例。在2004年，不屬于腦膜炎球菌帶的剛果民主共和國報(bào)道了1.1萬急性腦膜炎案例，腦膜炎帶似乎正在擴(kuò)大。

       腦膜炎球菌多糖和結(jié)合**

       腦膜炎多糖**類似于其他細(xì)菌多糖**，不能有效地刺激幼兒的免疫系統(tǒng)，對(duì)嬰兒無免疫原性。唯一例外的是A型腦膜炎球菌多糖因不太了解的原因在初次免疫時(shí)，6月齡的嬰兒產(chǎn)生免疫性。而在兩劑免疫計(jì)劃下，嬰幼兒可產(chǎn)生有效免疫。盡管如此，在使用了數(shù)以百萬劑量的A型腦膜炎球菌多糖**后，在非洲A型腦膜炎流行病還在持續(xù)爆發(fā)。

       發(fā)展和使用腦膜炎球菌多糖結(jié)合**已經(jīng)被論述過，本文主要聚焦于A型腦膜炎球菌多糖結(jié)合**。

       在商品化生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌結(jié)合**前，40年前，Beuvery和Jennings 、Lugowski等人進(jìn)行了最初關(guān)于A型腦膜炎球菌結(jié)合**生產(chǎn)與優(yōu)化的研究。他們描述了兩種結(jié)合A型多糖和蛋白的方法。第一種方法利用高碘酸鹽氧化部分解聚了的多糖的醛基端?；罨蟮娜┗瓮ㄟ^還原胺化反應(yīng)與存在于氰基硼氫化鈉環(huán)境下的載體蛋白的自由氨基段結(jié)合，大多數(shù)結(jié)合與賴氨酸處。該方法活性位點(diǎn)存在于多糖的特殊位點(diǎn)。第二種方法利用碳二亞胺共價(jià)連接高分子量的多糖羧酸基團(tuán)和載體蛋白的賴氨酸。使用第二種方法時(shí)，活化結(jié)合位點(diǎn)比較隨機(jī)。從生化角度來講，特異性的活化結(jié)合位點(diǎn)相較于隨機(jī)的活化位點(diǎn)，對(duì)多糖抗原表位損害較小，因此更具吸引力。

       Beuvery 等人制備了A型結(jié)合**免疫小鼠。使用六碳間隔的方法比在pH11時(shí)使用溴化氰在多糖上結(jié)合氰酸酯基團(tuán)的方法更具免疫原性。 好像高pH值會(huì)導(dǎo)致A型多糖o-乙?；膩G失。研究顯示o-乙?；鶎?duì)于A型多糖的免疫原性至關(guān)重要[15]。 A型結(jié)合**可以刺激T細(xì)胞依賴免疫，隨后單獨(dú)的多糖免疫起到增強(qiáng)的作用。Beuvery 研究顯示C型多糖結(jié)合**中的游離多糖需要減少（約10%），但不需要消除。

       A型單價(jià)多糖結(jié)合**在非洲發(fā)展應(yīng)用是因?yàn)椋海?）流行病學(xué)顯示在撒哈拉沙漠以南，A型單價(jià)多糖結(jié)合**可以預(yù)防90%當(dāng)?shù)丶膊『土餍行阅X膜炎球菌疾病。（2）相較于多價(jià)產(chǎn)品更廉價(jià)。

       因多糖結(jié)合**免疫反應(yīng)更持久，因此嬰兒對(duì)其免疫反應(yīng)更好。幾種腦膜炎球菌多糖結(jié)合**制備方式在相關(guān)文獻(xiàn)中被介紹。目前獲得許可的多糖結(jié)合**含有蛋白通過氨基酸共價(jià)結(jié)合修飾或活化后的多糖形成的蛋白-多糖雜交組合。蛋白部分可提供了T細(xì)胞抗原表位。這些T細(xì)胞抗原表位與輔助T細(xì)胞CD4相互作用，大大促進(jìn)了抗體對(duì)多糖的反應(yīng)。即使對(duì)嬰兒，多糖結(jié)合**引起的T細(xì)胞依賴性反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生血清免疫球蛋白G（IgG）和記憶B細(xì)胞。相比于自然多糖，多糖結(jié)合**的免疫原性不依賴于結(jié)合多糖的分子大小，結(jié)合多糖或寡聚糖表現(xiàn)為相同的免疫原性。A型多糖結(jié)合**對(duì)于高免疫原性所需要的分子量要求還未清楚論證。

       A型多糖結(jié)合**在非洲的發(fā)展

       來自受影響的西非國家的公共衛(wèi)生官員表示當(dāng)前需要時(shí)間去降低結(jié)合**的成本（在美國，0.5美元/劑）。但對(duì)于該價(jià)格，沒有制藥公司有興趣發(fā)展單價(jià)A型結(jié)合**用于撒哈拉沙漠以南地區(qū)。

       腦膜炎**項(xiàng)目（MVP）成立于2001年，旨在與發(fā)展中國家的制藥公司合作利用A型多糖結(jié)合**在非洲消滅流行性腦膜炎這一公共衛(wèi)生問題（印度血清研究所有限公司[SIIL]，浦那）。腦膜炎**項(xiàng)目工作人員選取了荷蘭Synco生物公司的**水平的A型多糖，SIIL來源的類毒素，和法國Aérial的熱穩(wěn)定配方；并選取了美國食品藥品監(jiān)督管理局生物制品評(píng)價(jià)研究中心細(xì)菌多糖實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的高效結(jié)合技術(shù)。在2004年到2006年，技術(shù)轉(zhuǎn)讓成功的實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室及中試水平。在2009年之前，腦膜炎**項(xiàng)目的目標(biāo)是每年生產(chǎn)2500萬劑**，到2012年，增加到多于5000萬劑**。在SIIL，多糖的生產(chǎn)、純化、結(jié)合過程實(shí)現(xiàn)了放大，最終在新廠區(qū)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，在申報(bào)臨床材料前對(duì)于原材料、結(jié)合物、產(chǎn)品的分析評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了制定與充分驗(yàn)證。最終論證認(rèn)為在生產(chǎn)的全過程，材料穩(wěn)定。

       對(duì)于規(guī)模的放大，尤其是產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，經(jīng)過了充分論證。分析SIIL兩年的產(chǎn)品數(shù)據(jù)，顯示全過程產(chǎn)率、游離多糖水平、蛋白多糖比非常令人滿意，標(biāo)志從實(shí)驗(yàn)室水平的工藝放大的成功。因此該技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到中試規(guī)模再到生產(chǎn)規(guī)模成功完成。

       A型多糖結(jié)合**生產(chǎn)與質(zhì)量控制

       多糖化學(xué)連接蛋白時(shí)，多糖需要活化即化學(xué)修飾。當(dāng)前主要的兩種多糖活化方法是高碘酸鹽氧化和氰基化作用。高碘酸鈉氧化二元醇（兩個(gè)相鄰的碳帶有羥基）成為醛（C=O），同時(shí)斷裂C-C鍵，使多糖糖環(huán)打開。對(duì)A型多糖而言，只有缺乏O-乙?；闹貜?fù)的3號(hào)碳可以被高碘酸鈉氧化，這樣可以起到保護(hù)A型多糖結(jié)合**。O-乙?；技兓疉型多糖的77%-85%，可以起到保護(hù)免疫原性的作用。

       對(duì)于大部分結(jié)合產(chǎn)物，在氰基硼氫化鈉存在下，活化的多糖的醛基會(huì)和蛋白的氨基結(jié)合形成穩(wěn)定的仲胺。多糖醛基與賴氨酸 ε-氨基的結(jié)合是一個(gè)緩慢的過程，經(jīng)常僅能獲得較低的產(chǎn)率。新的方法被發(fā)明出來降低結(jié)合時(shí)間，提高結(jié)合產(chǎn)率。結(jié)合效率通過同時(shí)活化多糖和蛋白載體蛋白方法提高活化的A型多糖與破傷風(fēng)類毒素（TT）或酰肼活化的破傷風(fēng)類毒素（TT-H）在室溫條件下反應(yīng)過夜（15-16小時(shí)）。相比于TT，多糖與TT-H結(jié)合可以獲得更高分子量的結(jié)合物。

       A型多糖-破傷風(fēng)結(jié)合**被分裝成1-2mg、25mg、500mg規(guī)格，用于驗(yàn)證結(jié)合方法的重復(fù)性和可測量性。如圖1，在酸性條件下，1-乙基-3（二甲氨基丙基）碳二亞胺條件下，TT的羧基被酰肼替代。A型多糖在無O-乙?；亩嗵翘嶤3-C4被高碘酸鈉部分氧化（圖1）。TT活度顯示每個(gè)TT分子50個(gè)酰肼基團(tuán)，而活化的A型多糖100個(gè)重復(fù)單位/每醛基。使用高效凝膠過濾色譜分離，206nm波長檢測未活化、活化后的TT和多糖及多糖-TT結(jié)合物。顯示活化后的TT分子量大小與未活化前相當(dāng)，保留時(shí)間在22 min，表明較少聚合產(chǎn)生（圖2）。活化后的多糖分子量變小，顯示部分降解。結(jié)合反應(yīng)之后一個(gè)高分子量的峰出現(xiàn)，表明A型多糖-TT結(jié)合物產(chǎn)生（圖2）。使用TT-H相較于TT，會(huì)產(chǎn)生較多結(jié)合產(chǎn)物。理化分析在生產(chǎn)過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行，并存在多種可選方案。Silveira等在研究使用TT-H法生產(chǎn)的C型腦膜炎多糖結(jié)合物時(shí)，使用核磁共振顯示在結(jié)合后，活化多糖醛基的消失。同時(shí)，也描述了用于表征腦膜炎球菌多糖結(jié)合物的物化方法，其中包括肼含量的測定。由于多糖上的多元醛結(jié)構(gòu)和TT上多元酰肼結(jié)構(gòu)，結(jié)合方法會(huì)產(chǎn)生高分子量的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。該方法還被用于C、W型多糖的結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)50%的結(jié)合物產(chǎn)率。

       （圖1） （圖2）

       動(dòng)物體A型多糖結(jié)合物免疫研究

       A型多糖-TT結(jié)合物通過S-400分子排阻色譜分離高分子量和低分子量的結(jié)合物。通過S-400分離柱，將結(jié)合物分離成4部分（16-20，21-25，26-30，31-35）去研究它們對(duì)小鼠的免疫原性。在注射小鼠3×1-μg多糖時(shí)，相較于游離多糖（≥為檢測結(jié)合物的質(zhì)量和效能，研究了MA031221J在低劑量條件（0.1-μg多糖劑量）下的免疫原性和添加-400%多糖或TT的影響（圖4）。第一次注射2周后，天然多糖和0.1-μg的多糖結(jié)合物僅引起較少的抗體（≤200units/mL），而1-μg可以產(chǎn)生顯著的抗體水平（≥1000-3000units/mL）。在第二次或第三次接種后，天然多糖可表現(xiàn)免疫原性（≤1000units/mL），而0.1-μg和1-μg結(jié)合物可引起較高水平抗體（≥220000units/mL）。多糖或TT的存在(-400%)對(duì)0.1-μg和1-μg結(jié)合物劑量有較小影響。

       在I期人體臨床實(shí)驗(yàn)前，多種GMP標(biāo)準(zhǔn)下，不同生產(chǎn)規(guī)模的A型多糖結(jié)合**在小鼠或兔子進(jìn)行安全性和免疫原性研究。

       （圖3） （圖4）

       A型多糖-TT結(jié)合**

       A型多糖-TT結(jié)合**凍干保存，使用前溶解，肌肉注射。**溶解于包含0.01%硫柳汞和0.3 mg三價(jià)鋁離子（以磷酸鋁記）鹽溶液中，0.5-mL/劑，包含10μg A型多糖結(jié)合10-33μg TT，0.06 mg Trs。最近在免疫擴(kuò)張項(xiàng)目，5-μg規(guī)格的**被WHO提前授權(quán)用于嬰幼兒免疫。

點(diǎn)擊下圖，即刻登記觀展！