對(duì)α-1-抗胰蛋白酶糖基化進(jìn)行直接的LC-MS/MS分析

熱門(mén)推薦： α-1-抗胰蛋白酶糖基化 ,

作者：ZXQ 來(lái)源：生物制品圈

2018-03-05

已經(jīng)開(kāi)發(fā)了以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）為基礎(chǔ)的方法來(lái)區(qū)分糖肽的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖的糖基化。通過(guò)完整的糖肽分析可以解析不同的糖基化位點(diǎn)（異質(zhì)性）以及每個(gè)位點(diǎn)上可能存在的多種糖鏈（微觀(guān)異質(zhì)性）。本研究中使用含有核心-和天線(xiàn)-巖藻糖糖基化位點(diǎn)的血清糖蛋白α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）。使用唾液酸酶去除唾液酸以簡(jiǎn)化糖基化的微觀(guān)異質(zhì)性，并可以增強(qiáng)具有類(lèi)似糖鏈結(jié)構(gòu)糖肽的MS信號(hào)。使用β1-3,4半乳糖苷酶來(lái)區(qū)分核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化。我們發(fā)現(xiàn)源內(nèi)裂解嚴(yán)重影響低豐度糖鏈修飾的糖肽鑒定和定量。因此需要對(duì)質(zhì)譜儀參數(shù)進(jìn)行設(shè)定以最小化源內(nèi)裂解。使用三步法質(zhì)譜裂解策略進(jìn)行糖肽的識(shí)別，并通過(guò)pGlyco軟件注釋和人工檢查進(jìn)一步確定。用于初始糖肽片段化的碰撞能量對(duì)提高氧鎓離子的檢測(cè)以及更好地選擇Y1離子（肽+GlcNAc）至關(guān)重要。結(jié)構(gòu)配置顯示A1AT糖肽的所有3個(gè)糖基化位點(diǎn)都含有復(fù)雜的N-糖鏈結(jié)構(gòu)：Asn70位點(diǎn)含有沒(méi)有巖藻糖基化的二天線(xiàn)糖鏈；Asn107位點(diǎn)含有核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的二天線(xiàn)，三天線(xiàn)和四天線(xiàn)糖鏈；Asn271位點(diǎn)含有核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的二天線(xiàn)和三天線(xiàn)糖鏈。Asn107位點(diǎn)上的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的相對(duì)強(qiáng)度與A1AT蛋白相似，表明Asn107位點(diǎn)的糖基化水平比其他2個(gè)位點(diǎn)高得多。

1.前言

異常蛋白質(zhì)的糖基化尤其是巖藻糖基化與各種疾病相關(guān)，例如癌癥[1]。核心巖藻糖基化是指巖藻糖連接到N-糖鏈的核心-N-乙酰葡糖胺上形成的，而天線(xiàn)巖藻糖基化則是巖藻糖連接到天線(xiàn)-N-乙酰葡糖胺或半乳糖上形成的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的核心-或天線(xiàn)-巖藻糖基化的變化指示各種癌癥的發(fā)生。例如，血清中α-胎兒球蛋白（AFP-L3）的核心-巖藻糖基化水平的增加被發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌有關(guān)[2]?；诿庖叻治龇ê蚅CA對(duì)核心-巖藻糖基化糖蛋白的高親和力，AFP-L3使用小扁豆凝集素（LCA）印跡試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)[3]。另一個(gè)例子是CA19-9，一種天線(xiàn)-巖藻糖基化唾液酸化路易斯A（lewis A）結(jié)構(gòu)。血清中CA19-9水平的升高是胰腺癌最廣泛使用的臨床指標(biāo)[4]。使用唾液酸化路易斯A結(jié)構(gòu)的特異性抗體通過(guò)免疫分析法來(lái)檢測(cè)CA19-9[4]。該方法依賴(lài)于特異性抗體，因此不能輕易應(yīng)用于其他糖蛋白。除了上述基于免疫分析法的方法之外，用于核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化分析的另一種常規(guī)方法涉及各種巖藻糖苷酶的組合以及從糖蛋白中釋放糖鏈后通過(guò)HPLC對(duì)糖鏈進(jìn)行幾個(gè)循環(huán)的分離[5]。盡管最近開(kāi)發(fā)的固定化PNGase F消化程序使糖鏈可以從糖蛋白中快速釋放[6]，但該巖藻糖苷酶消化的方法是冗長(zhǎng)的。更重要的是，大多數(shù)蛋白質(zhì)具有多個(gè)巖藻糖基化位點(diǎn)，上述分析丟失了位點(diǎn)特異性信息，因此不能提供蛋白質(zhì)的核心-或天線(xiàn)-巖藻糖基化異常的直接證據(jù)，而該證據(jù)是精準(zhǔn)診斷的關(guān)鍵。

許多研究一直在探索基于MS的完整糖肽分析，例如改善質(zhì)譜儀的靈敏度，分辨率和裂解模式以及開(kāi)發(fā)用于糖肽數(shù)據(jù)分析的軟件[7,8]。這些研究過(guò)程中一直使用CID，ECD，ETD，EThcD，低能量和高能量HCD等裂解方式或這些裂解方式的組合來(lái)闡明糖肽的結(jié)構(gòu)[9-11]。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于闡明這些譜圖的幾種不同軟件，其中Byonics[12]和GPQuest[13]是目前使用最廣泛的軟件。然而B(niǎo)yonics依賴(lài)于基于肽段序列的得分，低估了糖肽的假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率[14]，GPQuest需要一個(gè)樣品來(lái)源的肽數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)匹配糖肽，這使得實(shí)驗(yàn)更加復(fù)雜[13]。在這里，我們使用了Yang PY和He SM團(tuán)隊(duì)中新開(kāi)發(fā)的pGlyco軟件來(lái)幫助糖肽的質(zhì)譜分析。pGlyco使用HCD MS2產(chǎn)生的氧鎓離子來(lái)過(guò)濾糖肽，在Y1離子上使用HCD MS3進(jìn)行肽段測(cè)序，并使用CID MS2進(jìn)行糖鏈的解析[15]。pGlyco2.0是一個(gè)更新版本，它使用了階梯式HCD碰撞[14]。雖然pGlyco中MS3的參與使得掃描速度稍慢，但與pGlyco 2.0相比，它能夠手動(dòng)檢查具有更復(fù)雜片段的糖鏈結(jié)構(gòu)和肽段序列。因此，我們使用pGlyco作為首選方法。

單獨(dú)使用LC-MS/MS，由于它們?cè)贑18色譜柱上相似的保留時(shí)間和糖肽相同的質(zhì)核比[16]，因此通常難以區(qū)分核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化，并且在MS/MS裂解過(guò)程中巖藻糖可能發(fā)生從天線(xiàn)-到核心-位置的遷移[17]。糖鏈衍生化例如全甲基化能夠解決巖藻糖遷移的問(wèn)題，但是在衍生化之前需要從糖肽中釋放糖鏈，以致位點(diǎn)特異性信息丟失[17,18]。因此，我們?cè)噲D開(kāi)發(fā)一種在進(jìn)行LC-MS/MS之前區(qū)分核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的方法，并使用pGlyco促進(jìn)核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化鑒定和半定量的質(zhì)譜分析。在本研究質(zhì)譜分析前，我們應(yīng)用唾液酸酶和半乳糖苷酶雙重消化來(lái)區(qū)分核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化。使用唾液酸酶去除唾液酸以簡(jiǎn)化糖基化微觀(guān)異質(zhì)性并增強(qiáng)糖肽的MS信號(hào)。β 1-3,4半乳糖苷酶（來(lái)自牛睪丸）用于區(qū)分核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化，其中半乳糖苷酶不能從天線(xiàn)-巖藻糖基化的路易斯結(jié)構(gòu)釋放半乳糖[19]。

血清蛋白α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）的巖藻糖基化水平已被確定為各種癌癥[20,21]和炎癥[22]的潛在生物標(biāo)志物。本研究中，糖肽的唾液酸酶和半乳糖苷酶雙重消化之后直接進(jìn)行LC-MS/MS分析，而不從糖肽中釋放糖鏈。通過(guò)對(duì)A1AT的糖肽的成功鑒定和半定量以及核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的明確區(qū)分，解析了糖基化位點(diǎn)和每個(gè)位點(diǎn)上多種可能的糖鏈。

2.材料方法

2.1胰蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段：我們向10μg α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）中加入10μL 50mM的碳酸氫氨并用移液器吹打充分溶解樣品。溶解的A1AT樣品用10mM tris（2-羧乙基）***（TCEP）在37℃下還原30分鐘并用20mM碘乙酰胺（IAA）在室溫下避光烷基化15分鐘。用50mM碳酸氫氨將樣品溶液稀釋3倍，加入1μL 0.5μg/μL的胰蛋白酶（Promega，Madison，WI）在37℃下孵育16小時(shí)。最后95℃下孵育5分鐘使胰蛋白酶失活并通過(guò)真空離心機(jī)干燥樣品。

2.2糖肽的富集和緩沖液置換：使用3K Ultra離心過(guò)濾器-15（Millipore Amicon）進(jìn)行糖肽富集和緩沖液置換。離心機(jī)設(shè)置為7,500g，1小時(shí)，重復(fù)3次將緩沖體系由上述體系置換為25mM的乙酸鈉（pH5.5）。修飾的糖肽大于3K，因此只有小于3K的非糖肽類(lèi)才能透過(guò)3K濾膜。

2.3唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化：對(duì)于唾液酸酶和半乳糖苷酶消化，將30μL 25mM乙酸鈉溶液中的糖肽混合物與15mU（3μL）來(lái)自大腸桿菌（(Prozyme, Hayward, CA)）中表達(dá)的非特異性α2-3,6,8,9唾液酸重組酶以及75mU（3μL）來(lái)自牛睪丸（Prozyme，Hayward，CA）的β1-3,4半乳糖苷酶在37℃下溫育18小時(shí)以除去所有唾液酸酸殘基和半乳糖，前提是巖藻糖沒(méi)有連接到N-糖鏈末端的N-乙酰葡糖胺上。糖苷酶在95℃下5分鐘失活。

2.4 C18脫鹽：加入三氟乙酸（TFA）直到pH值達(dá)到2。用200μL含有0.1％TFA的50％乙腈溶液活化C18柱（Fisher Scientific，San Jose，CA）5次，并用0.1％的TFA水溶液平衡3次，每次1500g/min離心1min。將多肽與C18珠子結(jié)合5次，然后用0.1％的TFA洗滌3次通過(guò)上述離心程序去除非特異性結(jié)合；使用20μL含有0.1％TFA的50％乙腈溶液通過(guò)上述離心程序進(jìn)行洗脫。重復(fù)洗脫一次，然后通過(guò)真空離心機(jī)干燥合并的洗脫液。

2.5 糖肽的LC-MS鑒定

Nano LC-MS/MS工作條件如先前研究中所述[23]。C18毛細(xì)管柱（100μm×15cm；3μm粒徑，200?)）（Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA）用于LC分離，梯度洗脫使用Ultimate 3000 nanoLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA），流速為350nL/min。流動(dòng)相A為0.1％的甲酸水溶液中含有2％的乙腈，流動(dòng)相B為乙腈溶液中含有0.1％的甲酸和2％的水。分析方法的梯度時(shí)長(zhǎng)100分鐘，其中平衡10分鐘后，流動(dòng)相B的梯度組成為：2min內(nèi)由3％上升到7％，8min內(nèi)再?gòu)?％上升到14％，55min內(nèi)從14％上升到25％隨后進(jìn)行洗滌和平衡步驟：其中流動(dòng)相B在5min內(nèi)增加至90％并保持8min，然后在0.1min內(nèi)返回至3％并保持17min。

使用以正離子模式操作的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，圣荷西，美國(guó)加州）進(jìn)行分析。ESI噴霧電壓和毛細(xì)管電壓的設(shè)定如下文所述。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行兩次LC-MS分析。每次運(yùn)行包括兩個(gè)連續(xù)的MS掃描類(lèi)型。在第一次運(yùn)行中，通過(guò)低能量HCD MS2檢測(cè)氧鎓離子138.05來(lái)選擇糖肽；來(lái)自糖肽的Y1離子（肽+GlcNAc）通過(guò)高能量HCD MS3用于肽段測(cè)序。在第二次運(yùn)行中，在通過(guò)低能HCD MS2選擇糖肽后，將所選擇的糖肽進(jìn)行CID MS2用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析。正如結(jié)果部分所討論的那樣，為了更好地檢測(cè)氧鎓離子，更好地選擇Y1離子以及更好地裂解Y1離子和糖鏈，每個(gè)裂解步驟的碰撞能量也進(jìn)行了優(yōu)化。全掃描定義質(zhì)量范圍為m/z 600到1800，MS/MS采用速度模式。

2.6 糖肽鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索:

He SM團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的搜索引擎pGlyco和pFind用于糖蛋白的分析。兩次LC-MS運(yùn)行的原始數(shù)據(jù)首先需要一致以確保兩次運(yùn)行中相同前體離子的保留時(shí)間相同。pFind通過(guò)使用來(lái)自第一次LC-MS運(yùn)行的MS3譜圖來(lái)進(jìn)行Y1肽段鑒定：（1）固定化修飾：半胱氨酸的脲基甲基化（+57.021Da）；（2）動(dòng)態(tài)修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995Da）和N-乙酰己糖胺（+203.075Da）；（3）允許錯(cuò)過(guò)一次裂解；（4）肽段離子公差：15ppm；（5）碎片離子公差：25ppm。從第一次LC-MS運(yùn)行中鑒定的Y1肽段和第二次LC-MS運(yùn)行的原始數(shù)據(jù)被輸入到pGlyco中進(jìn)行糖肽匹配和評(píng)分。所有鑒定的糖肽均由EURO CarbDB開(kāi)發(fā)的GlycoWorkbench軟件進(jìn)行手動(dòng)檢查[24]。根據(jù)糖生物學(xué)基礎(chǔ)[25]使用糖鏈的命名規(guī)則，根據(jù)NIBRT GlycoBase使用縮寫(xiě)。

3.結(jié)果與討論

N-連接糖蛋白的兩種巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化，已被認(rèn)為是各種癌癥中的生物標(biāo)志物[1]。通常很難區(qū)分這兩種結(jié)構(gòu)。因此，我們?cè)噲D開(kāi)發(fā)一種方法來(lái)區(qū)分目標(biāo)蛋白的每個(gè)糖基化位點(diǎn)上的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化。本研究的工作流程如圖1所示。簡(jiǎn)而言之，將血清蛋白α-1抗胰蛋白酶（A1AT）標(biāo)準(zhǔn)品消化成肽段，然后通過(guò)唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化處理用于糖基的切除。將處理后的糖肽半富集并通過(guò)3K濾膜脫鹽后直接通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行分析。因此A1AT的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化被成功地區(qū)分和定量。

血清蛋白的總體巖藻糖基化水平相當(dāng)?shù)蚚26]。利用用于肽分析的常規(guī)質(zhì)譜設(shè)置，將發(fā)生糖肽的源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)的解離（也稱(chēng)為噴霧分離器解離，在此縮寫(xiě)為源內(nèi)解離）。這是離子從大氣壓離子源轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀的真空室期間由于碰撞激發(fā)而導(dǎo)致解離的過(guò)程[27]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)糖肽的源內(nèi)解離嚴(yán)重影響低豐度巖藻糖基化肽段的鑒定和半定量。但是，迄今為止還沒(méi)有對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行詳細(xì)分析。以A1AT糖肽中最豐富的糖基修飾類(lèi)型A2為例，A2在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后應(yīng)含有3個(gè)Hex（甘露糖），4個(gè)HexNAc（N-乙酰葡糖胺），0個(gè)NeuAc，0個(gè)NeuGlc和0個(gè)dHex，在這里簡(jiǎn)寫(xiě)為34000。如圖2所示，使用賽默飛開(kāi)發(fā)的Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀（離子傳輸管溫度=300℃，RF=30%）[28]，通過(guò)“常規(guī)”方法設(shè)定或更嚴(yán)格的設(shè)定進(jìn)行肽段分析發(fā)現(xiàn)超過(guò)20%的34000糖鏈被衰減到23000（以XIC23000 / XIC34000計(jì)算）。因此優(yōu)化了用于糖肽分析的一系列MS設(shè)定。我們發(fā)現(xiàn)在較低溫度和較低的RF（150℃，20%）條件下，糖肽的源內(nèi)解離降低到3%以下，而含有34001糖鏈的核心-巖藻糖基化肽段的信號(hào)沒(méi)有顯著降低。我們還發(fā)現(xiàn)，較高的噴霧電壓（噴霧電壓> 2300 V）會(huì)提供更高的信號(hào)，但同時(shí)也增加了源內(nèi)解離。因此使用穩(wěn)定噴霧的噴霧電壓2300 V。該優(yōu)化的設(shè)定條件用于進(jìn)一步鑒定A1AT糖肽的位點(diǎn)特異性糖基化以及對(duì)核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化進(jìn)行半定量。

圖3顯示了直接的LC-MS/MS策略，首先通過(guò)用低能HCD MS2檢測(cè)氧鎓離子138.05來(lái)選擇糖肽（圖3A）；然后將來(lái)自糖肽片段的Y1離子進(jìn)行高能量HCD MS3（圖3B）用于肽段測(cè)序；而所選擇的糖肽進(jìn)行CID MS2（圖3C）用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析；圖3D中總結(jié)了整個(gè)流程。第一步的HCD碰撞能量（CE）對(duì)糖肽的片段化至關(guān)重要。它針對(duì)提高氧鎓離子的檢測(cè)和Y1離子的選擇進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4所示，對(duì)于含有Asn271位點(diǎn)的非巖藻糖基化以及核心-巖藻糖基化或天線(xiàn)-巖藻糖基化的二天線(xiàn)糖肽，當(dāng)CE為24（從CE20到CE32的一系列HCD中）時(shí)的低能量HCD MS2提供了最強(qiáng)的Y1離子片段。這種最適的CE似乎與糖鏈結(jié)構(gòu)或肽段序列無(wú)關(guān)。如糖肽（含有Asn271位點(diǎn)）所示，無(wú)論是非巖藻糖基化還是核心-巖藻糖基化或天線(xiàn)-巖藻糖基化結(jié)構(gòu)都具有相同的最適CE（圖4），其中AlAT的其他2種糖肽（含有Asn107或Asn70位點(diǎn)）也具有相同的最適CE（補(bǔ)充信息-圖S1）。

與此相反，第二步用于肽注釋的HCD CE和第三步用于糖鏈注釋的CID CE靈敏度卻不高。當(dāng)CE為35、38或40時(shí)，HCD MS3均顯示出相似的裂解模式（如圖5所示），其中HCD MS3 CE35對(duì)較高m/z的片段產(chǎn)生的信號(hào)稍強(qiáng)。糖肽的糖鏈結(jié)構(gòu)在CID CE30和CE35下均顯示出相似的裂解模式（圖6）。因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中，分別使用低能量HCD CE24，CID CE30和高能量HCD CE 35。

唾液酸酶釋放α 2-3,6,8,9-N-乙酰神經(jīng)氨酸，導(dǎo)致N-糖鏈的末端變?yōu)榘肴樘?。隨后，β-半乳糖苷酶切除β 1-3,4半乳糖，前提是沒(méi)有巖藻糖與N-糖鏈末端N-乙酰葡糖胺結(jié)合，因此提供了區(qū)分核心-巖藻糖基化和天線(xiàn)-巖藻糖基化的方法[19]。在唾液酸酶消化的樣品中核心-巖藻糖基化和天線(xiàn)-巖藻糖基化糖肽具有相同的m/z（圖7.B），因此唾液酸酶消化樣品的圖譜是核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化肽段的混合物（圖7.B1）。相比之下，唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化的樣品中核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化肽段具有不同的m/z（圖7.A）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶對(duì)糖肽進(jìn)行雙重消化后，不需要進(jìn)一步的MS/MS分析或大量連續(xù)的外切糖苷酶消化就可以區(qū)分出兩種類(lèi)型的巖藻糖基化，這與之前在糖鏈水平上的工作相似[19]。此外，用唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，天線(xiàn)-巖藻糖基化糖肽的保留時(shí)間早于其相應(yīng)的核心-巖藻糖基化糖肽（圖7.A），表明半乳糖增強(qiáng)了其親水性。我們發(fā)現(xiàn)核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化糖肽的洗脫時(shí)間和裂解模式都不相同。在核心-巖藻糖基化糖肽的CID MS/MS圖譜中，可以觀(guān)察到幾個(gè)核心-巖藻糖基化糖肽片段（圖7.A1）；而在天線(xiàn)-巖藻糖基化糖肽的CID MS/MS圖譜中出現(xiàn)的三個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的片段為pep-43001，pep-43000和pep-33001（圖7.A2）。其他糖肽中也發(fā)現(xiàn)了核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化裂解模式的差異（圖S2）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，可以通過(guò)直接LC-MS/MS分析獲得核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化肽段之間的穩(wěn)定差異。傳統(tǒng)的外切糖苷酶與巖藻糖苷酶α 1-2,3,4,6和巖藻糖苷酶α 1-3,4也可以進(jìn)一步應(yīng)用于唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化的糖肽，顯示了該策略的有效性（圖S3）。

在之前的研究中，我們分析了從糖蛋白A1AT上釋放的糖鏈，發(fā)現(xiàn)A1AT在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后有12種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)[19]。在本研究中，我們鑒定了10個(gè)特定糖基化位點(diǎn)上的這些結(jié)構(gòu)。它們?cè)贑18色譜柱上的保留時(shí)間及其相對(duì)強(qiáng)度如表1所示。在補(bǔ)充信息-圖S2中顯示了所有鑒定糖肽的低能量HCD MS2，高能量MS3和CID MS2圖譜。含有Asn107位點(diǎn)的糖肽1 ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR（修飾的氨基酸顯示為小寫(xiě)）具有最多種類(lèi)的糖鏈修飾類(lèi)型，包括A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，F(xiàn)A3，A3FG，A4，F(xiàn)A4，A4FG，A3F2G2，而其他兩個(gè)位點(diǎn)具有比較少的糖鏈修飾類(lèi)型（含有Asn271位點(diǎn)的糖肽2YLGnATAIFFLPDEGK：A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，A3FG和含有Asn70位點(diǎn)的糖肽3 QLAHQSnSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTK：A2）。每個(gè)位點(diǎn)的糖基化程度可能取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者位點(diǎn)與某些氨基酸或N/C末端的接近程度[22]。如圖8（晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自[29]）所示，所有三個(gè)位點(diǎn)都位于蛋白質(zhì)表面和環(huán)中，其中Asn107幾乎位于大環(huán)的中心，并且可能更易接近各種糖基轉(zhuǎn)移酶，而Asn271和Asn70更接近α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)并且空間較小。這可能在某些方面解釋了為什么Asn107具有最多的糖基化修飾類(lèi)型。

正如預(yù)期所示，在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，核心-巖藻糖基化糖肽額外的巖藻糖使得糖肽更具親水性，因此其從C18柱的洗脫早于其相應(yīng)的二天線(xiàn)-和三天線(xiàn)糖鏈修飾的非巖藻糖基化糖肽。與相應(yīng)的核心-巖藻糖基化的情況相比，額外的半乳糖使天線(xiàn)-巖藻糖基化的二天線(xiàn)糖肽更加親水。然而，進(jìn)一步的半乳糖和/或巖藻糖沒(méi)有使得三-或四-天線(xiàn)糖肽更加親水，并且所有巖藻糖基化的三天線(xiàn)糖肽或四天線(xiàn)糖肽在非常緩慢的洗脫梯度（0.2%ACN /min）下洗脫時(shí)間相似。這表明在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，糖肽的疏水性主要由其肽骨架決定，只在二天線(xiàn)糖鏈中發(fā)現(xiàn)有輕微的疏水性變化。這種變化可能是由于與三天線(xiàn)-和四天線(xiàn)-糖鏈相比，二天線(xiàn)糖鏈具有較少的糖基，因此一個(gè)或兩個(gè)額外的糖基就可以導(dǎo)致糖肽總體疏水性更高。

我們先前對(duì)糖鏈的研究表明，非巖藻糖基化的二天線(xiàn)-和三天線(xiàn)-糖鏈?zhǔn)茿1AT中最豐富的兩個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)，分別占35.8％和25.2％[19]。在糖肽1和糖肽2的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Asn107上的二天線(xiàn)-和三天線(xiàn)-糖鏈修飾分別占48％和34％，而在A(yíng)sn271上分別為97％和1％（表1）。糖肽3的分析顯示Asn70上僅有A2糖鏈修飾；因此我們認(rèn)為Asn70上的糖鏈修飾對(duì)A1AT蛋白的整體糖基化沒(méi)有多少貢獻(xiàn)。卡方檢驗(yàn)用于比較從A1AT蛋白質(zhì)釋放的糖鏈類(lèi)型（數(shù)據(jù)來(lái)源于以前的結(jié)果[19]）和糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)）的糖鏈修飾類(lèi)型或糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）的糖鏈修飾類(lèi)型（表2）之間的主要糖鏈修飾類(lèi)型的相對(duì)峰強(qiáng)度。從A1AT蛋白釋放的糖鏈類(lèi)型與Asn271上的糖鏈修飾類(lèi)型顯著不同（p值一項(xiàng)經(jīng)典的凝集素印跡試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，核心-巖藻糖基化而非天線(xiàn)-巖藻糖基化的A1AT的上調(diào)可以作為肝細(xì)胞癌診斷的指標(biāo)[20]，而A1AT的天線(xiàn)-巖藻糖基化可以作為炎癥發(fā)生的指標(biāo)，尤其是在HBV感染的患者中[22]。我們先前的糖鏈研究表明，二天線(xiàn)-核心-巖藻糖基化是A1AT蛋白質(zhì)中最豐富的核心-巖藻糖基化類(lèi)型。從表1中我們可以推斷，如果患者的A1AT核心-巖藻糖基化類(lèi)型發(fā)生改變，Asn107位點(diǎn)上的二天線(xiàn)-核心-巖藻糖基化很可能是通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行精確監(jiān)測(cè)和定量的合適目標(biāo)。另一種經(jīng)典的基于凝集素印跡的研究表明，A1AT巖藻糖基化水平的總體升高能夠區(qū)分肺腺癌與良性病變或其他肺癌亞型[21]。本研究中開(kāi)發(fā)的策略將能夠鑒定和定量A1AT特定位點(diǎn)上的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化。在今后的工作中，這種方法將被用于研究各種癌癥發(fā)展過(guò)程中血清A1AT糖基化的變化。包括特異性位點(diǎn)信息的更精確的巖藻糖基化分析能夠提供更高的診斷價(jià)值。此外，該策略可應(yīng)用于各種疾病發(fā)展期間其他關(guān)鍵糖蛋白的研究。

4.結(jié)論

我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一條渠道來(lái)研究A1AT的糖基化，以確定核心-與天線(xiàn)-巖藻糖基化的存在，而不用從糖肽中分離糖鏈和肽段。這是在A(yíng)1AT蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品上進(jìn)行的，該蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切，隨后進(jìn)行唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化。除了末端N-乙酰葡糖胺被巖藻糖基化修飾外，半乳糖苷酶可以去除N-糖鏈中的末端半乳糖殘基，從而提供區(qū)分核心-巖藻糖基化和天線(xiàn)-巖藻糖基化的手段。糖鏈的位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)可以通過(guò)該方法同時(shí)鑒定。我們?cè)谔请腝LAHQSnSTNIFFSPVSIATA的Asn70位點(diǎn)上鑒定了1個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)（A2），在糖肽ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR的Asn107位點(diǎn)上鑒定獲得10個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)（A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，F(xiàn)A3，A3FG，A4，F(xiàn)A4，A4FG和A3F2G2）以及糖肽YLGnATAIFFLPDEGK的Asn271位點(diǎn)上鑒定獲得5個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)（A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3和A3FG）。我們相信該方法將廣泛用于在各種疾病發(fā)展期間對(duì)A1AT或其他關(guān)鍵糖蛋白上的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化進(jìn)行鑒定和定量。

補(bǔ)充信息

圖S1糖肽1，糖肽2或糖肽3具有相同的最適低能量HCD CE24。

圖S2所有鑒定的具有不同糖基修飾類(lèi)型糖肽：糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)），糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）和糖肽3（含有Asn70位點(diǎn)）的低能量HCD MS2，高能量HCD MS3和CID MS2圖譜。

圖S3唾液酸酶/半乳糖苷酶消化的A1AT樣品，唾液酸酶/半乳糖苷酶/α 1-2,3,4,6巖藻糖苷酶消化的A1AT樣品以及唾液酸酶/半乳糖苷酶/α 1-3,4巖藻糖苷酶消化的A1AT樣品中的巖藻糖基化糖肽的XIC（提取離子流圖）圖譜。

表1.雙重消化后的A1AT糖肽以及每個(gè)位點(diǎn)的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化的相對(duì)峰面積的總結(jié)。

表2.卡方檢驗(yàn)用于比較從A1AT蛋白質(zhì)釋放的糖鏈類(lèi)型（數(shù)據(jù)來(lái)源于以前的結(jié)果[19]）和糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)）的糖鏈修飾類(lèi)型或糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）的糖鏈修飾類(lèi)型（表2）之間的主要糖鏈修飾類(lèi)型的相對(duì)峰強(qiáng)度。

* p值< 0.05 認(rèn)為差異顯著

圖1 鑒定A1AT糖基化的實(shí)驗(yàn)工作流程。首先將糖基化的A1AT酶切成肽段，然后通過(guò)唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化進(jìn)行糖基的切除。將糖肽進(jìn)行直接LC-MS/MS分析而不需要釋放糖鏈。

圖2在不同的離子傳輸管溫度，噴霧電壓和RF％設(shè)定條件下，具有A2和FA2糖基修飾類(lèi)型的A1AT糖肽（Asn271）的源內(nèi)裂解。

圖3具有A2FG糖基修飾類(lèi)型的A1AT糖肽（Asn271）的圖譜：（A）低能量HCD MS2圖譜；（B）低能量HCD誘導(dǎo)的高能量HCD MS3圖譜；（C）低能量HCD誘導(dǎo)的CID MS2；（D）糖肽裂解的示意圖。

圖4 各種低能量HCD碰撞能量下具有A2，F(xiàn)A2和A2FG糖基修飾類(lèi)型糖肽（Asn 271）的MS2裂解模式，表明CE24下的低能量HCD產(chǎn)生信號(hào)最強(qiáng)的Y1離子（肽+GlcNAc）。

圖5 各種高能量HCD碰撞能量下糖肽（Asn271）Y1離子（肽+GlcNAc）的MS3裂解模式，表明在CE35下的高能量HCD提供了的裂解圖譜。

圖6 在各種CID碰撞能量下具有A2，F(xiàn)A2和A2FG糖基修飾類(lèi)型的糖肽（Asn271）的MS2裂解模式，表明在CE30或CE35下這些糖肽獲得了相似的裂解圖譜。

圖7 通過(guò)唾液酸酶/半乳糖苷酶消化來(lái)區(qū)分糖肽（Asn271）的核心-和天線(xiàn)-巖藻糖基化（A：保留時(shí)間；A.1：FA2的圖譜；A.2：A2FG的圖譜）。作為對(duì)照，唾液酸酶消化的情況下沒(méi)有觀(guān)察到差異（B：保留時(shí)間；B.1：A2G2（F）的圖譜）。