重組胰蛋白酶酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

（96T）

使用前請仔細(xì)閱讀說明書。若有任何問題，請聯(lián)系我們。

試劑盒用途

本試劑盒用于體外定量檢測大腸菌液體中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業(yè)生產(chǎn)使用。

試劑盒基本參數(shù)

靈敏度 < 1 ng/ml

檢測范圍：0.078 - 40 ng/ml

特異性：可檢測重組胰蛋白酶，與其它重組大腸菌表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng)。

重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均 < 10%。

工作時間：熟練實驗人員可在2.5小時內(nèi)完成一次測定。

有效期：6個月

試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

說明:

1、所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染。

2、酶標(biāo)板-20℃可存放6個月，2-8℃存放勿超過一周。

試驗所需自備物品

1.酶標(biāo)儀（濾光片波長450 nm和650nm）

2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.潔凈吸水紙

待測樣品注意事項

1.樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或 -80℃（3個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。

2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再測。

3.若使用化學(xué)裂解液制備的樣本或細(xì)胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。

檢測前準(zhǔn)備工作

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。提前15分鐘打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。

2.洗滌液配制

將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1：25）。

 提示：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液溫度應(yīng)為室溫）。請當(dāng)日使用。

3.標(biāo)準(zhǔn)品配制

將標(biāo)準(zhǔn)品于1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為10 ng/mL）, 然后進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度:  10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/mL。

倍比稀釋方法

取7只EP管，每管中加入500 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，從10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL樣品稀釋液的EP管中混勻配成5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋圖例（以500 μL為例）

提示：一管直接作為空白孔。

4.HRP標(biāo)記抗體工作液配制

實驗前請先將抗體管低速離心，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。計算實驗所需用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL。使用前15分鐘，用抗體稀釋液將HRP-標(biāo)記抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：250），當(dāng)日使用。

5.TMB顯色工作液配制

實驗前計算實驗所需用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL。使用前15分鐘，用底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液 =1：20），當(dāng)日使用。

洗滌方法

1. 自動洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350 μL， 注入和吸出間隔60秒。
2. 手工洗板： 甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈厚吸水紙上拍干，每孔加入洗滌液350 μL，浸泡2-3分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉板內(nèi)液體，在潔凈厚吸水紙上拍干。

操作步驟

1.將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣加入到其他孔，每孔100 μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標(biāo)板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。

提示：加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。

2.洗滌：棄去液體，甩干，在潔凈厚吸水紙上拍干。每孔加入 洗滌液-1 350 μL，浸泡2-3分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉板內(nèi)液體，在潔凈的厚吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。

3.每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL，混勻，酶標(biāo)板覆膜并置于37℃孵育30分鐘。    

4.洗滌：用 洗滌液1 洗板3次，方法步驟同2。

5.洗滌：用 洗滌液2 洗板2次，方法步驟同2。，

6.每孔加底物顯色工作液（TMB）100 μL，酶標(biāo)板覆膜并置于37℃ 孵育10分鐘。

提示: 根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，顯色時間在5-30分鐘范圍內(nèi)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。

7.每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，室溫放置1分鐘。

提示: 終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果。

8.用酶標(biāo)儀在450 nm波長（參考波長650nm）測量各孔的光密度（OD_{450/650 nm}值）。

 提示: 請?zhí)崆按蜷_酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置檢測程序。

結(jié)果判斷

1.計算每組復(fù)孔的平均OD值。每個標(biāo)準(zhǔn)品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X），OD值為縱坐標(biāo)（Y），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（作圖時亦可去掉空白組的值）。

2.推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（請使用Logistic五參數(shù)擬合曲線計算方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）等。

3.若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。

4.典型數(shù)據(jù)

由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意事項

1. 儲存：試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發(fā)和微生物污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。暫時不用板條應(yīng)拆下后放入備用自封袋，按推薦溫度存放。
3. 加樣：加樣和加同一試劑時，孔與孔之間加樣時間間隔過大將導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯的影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性，每次的加樣時間控制在10分鐘之內(nèi)，推薦設(shè)置復(fù)孔。
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標(biāo)板覆膜，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)。嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。
5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙或干布上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要清除酶標(biāo)板底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
6. 試劑配制：試劑盒在運(yùn)輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用1000轉(zhuǎn)/分離心一分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請精確配制。
7. 顯色時間的控制：加入底物后，請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔五分鐘），如梯度已經(jīng)很明顯，請?zhí)崆凹咏K止液終止反應(yīng)，以避免顏色過深，影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
8. 底物：請避光保存底物。在儲存和溫育時，避免強(qiáng)光直接照射。
9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器，使用頻率，如無微量振蕩器，可以在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
10. 不同批號的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。

問題分析

若實驗結(jié)果有問題，請及時對顯色結(jié)果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯(lián)系技術(shù)支持。也可參考以下信息以找出原因。